Konference: 2011 XXXV. Brněnské onkologické dny a XXV. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: Postery
Číslo abstraktu: 237p
Autoři: Ing. Dalibor Húska; Bc. Hana Kynclová; doc.Ing. Jaromír Hubálek, Ph.D.; doc.RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D.; prof. MUDr. Tomáš Eckschlager, CSc.; doc.Ing. René Kizek, Ph.D.
Klíčová slova: DNA, interkalace, doxorubicin,
elektrochemie
Úvod
V poslední době stále více roste zájem o vývoj biosenzorových metod, které by napomohly k analýze molekulárních vlastností deoxyribonuklové kyseliny (DNA) případně ke sledování její interakce s dalšími biomolekulami či léčivy. Bylo v řadě prací ukázáno, že elektrochemické metody jsou pro takové účely vhodné (Huska, et al., Huska, et al., Zitka, et al., Huska, et al.). Navíc lze tyto postupy využít pro diagnostiku nebo sledování pravděpodobných lékových interakcí. Jedním z protinádorových léčiv je i doxorubicin. Řadí se mezi antracyklinová antibiotika (Huska, et al., Drummond, et al.). Primárním cílem antracyklinů je buněčná DNA. Jednou z možností účinku je interkalace (vmezeření) doxorubicinu do DNA, což vede k zastavení syntézy DNA (Box, Kellogg, et al.). Pro zvýšení účinnosti léku je potřeba co nejlépe znát jeho interakci s DNA. V naší práci je tato interakce studována pomocí elektrochemických metod. Byly studovány interakce doxorubicinu s DNA izolované z rezistentních a senzitivních buněk a hledána vzájemná korelace.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
Materiál a metody
Elektrochemie
Elektrochemické stanovení s visící rtuťovou kapkovou elektrodou (HMDE; s plochou kapky 0,4 mm2) jako pracovní elektrodou bylo provedeno pomocí přístroje AUTOLAB analyzátor (EcoChemie, Holandsko), ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Švýcarsko). Byla používána pracovní cela s tříelektrodovým zapojením. Referenční elektroda byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocná elektroda byla uhlíková tyčinka. Základní elektrolyt acetátový pufr (pH 4,6-5,0). LSV parametry: počátek a konec potenciálového okna: 0 V, a –1,65 V, potenciálový krok: 5 mV, rychlost polarizace: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 160, 320, 400, 640, 800, 1280, 2560 mV/s.
Statistická analýza
Statistická analýza byla provedena Turkeyho testem.
Biologický material
Buněčné linie IMR-32 byly získány z izolací z tkáňových buněčných kultur neuroblastomu. Pro měření byla použita DNA izolovaná z buněk senzitivních k doxorubicinu a buněk rezistentních k doxorubicinu.
Postup izolace DNA
DNA byla izolována za využití kitu Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI USA) – principem je lýza buněk, enzymatická digesce RNA, vysolení proteinů a precipitace genomické DNA isopropanolem.
Určení koncentrace DNA
Koncentrace DNA byla určena spektrofotometricky (Bio Mate™3, Hermo spectronic, Orchester NY, USA), DNA mají absorpční maximu v okolí 260 nm, molekuly proteinů v okolí 280 nm.
Výsledky a diskuse
Pro sledování interakce protinádorového léčiva doxorubicinu s DNA jsme využili elektrochemickou techniku cyklické volumetrie. Byla měřena DNA izolovaná z buněk senzitivních a rezistentních k doxorubicinu. Získali jsme charakteristický voltamogram DNA izolované z buněk. Na průběhu záznamu jsme pozorovali dva píky. První pík (1) odpovídá redukčnímu signálu cytosinu a adeninu (kolem potenciálu –1.5 V), druhý pík (2) odpovídá oxidačnímu signálu guaninu (kolem potenciálu –0.2 V). Dále jsme studovali vliv 0,1 µM a 1 µM koncentrace doxorubicinu na signál při rychlosti polarizace 1280 mV/s. DNA izolovaná jak z rezistentních tak i senzitivních buněk byla tedy měřena při různých rychlostech polarizace. Získali jsme lineární závislosti, ze kterých jsme určili směrnice přímek, které jsme porovnávali se směrnicemi kontrolního vzorku (buňky kultivované bez přítomnosti doxorubicinu). Obr. 1 a 2 ukazuje průměrné hodnoty směrnic v závislosti na koncentraci doxorubicinu pro resistentní, respektive senzitivní buňky. Na svislé ose jsou vyneseny hodnoty směrnic (k), jednotlivé sloupce odpovídají daným koncentracím. První sloupec odpovídá kontrolnímu vzorku (bez doxorubicinu). Na Obr. 1 můžeme pozorovat statistický rozdíl mezi vzorkem s koncentrací doxorubicinu 0,05 a kontrolním vzorkem. Pro ostatní koncentrace není rozdíl směrnic statisticky významný. Tím se potvrdila rezistence buněk, protože změna hodnoty průměrných směrnic se nemění v závislosti na koncentraci doxorubicinu.
Obr. 1 a 2. Porovnání průměrných hodnot směrnic s kontrolním vzorkem pro senzitivní vzorky
Závěr
Po vyhodnocení byly zjištěny rozdíly mezi směrnicí přímky senzitivních a rezistentních nádorových buněčných liniích, které jsou statisticky průkazné na hladině významnosti α = 0,05. Průměrný rozdíl hodnot směrnic přímek senzitivních a rezistentních buněk je ∆k = 0.167±0.083. Ze získaných experimentálních dat vyplívá, že elektrochemické metody jsou vhodné pro analýzu a posuzování rezistence a senzitivity buněk na protinádorová léčiva.
Literatura:
*) Korespondenční autor: dalih@centrum.cz
Úvod
V poslední době stále více roste zájem o vývoj biosenzorových metod, které by napomohly k analýze molekulárních vlastností deoxyribonuklové kyseliny (DNA) případně ke sledování její interakce s dalšími biomolekulami či léčivy. Bylo v řadě prací ukázáno, že elektrochemické metody jsou pro takové účely vhodné (Huska, et al., Huska, et al., Zitka, et al., Huska, et al.). Navíc lze tyto postupy využít pro diagnostiku nebo sledování pravděpodobných lékových interakcí. Jedním z protinádorových léčiv je i doxorubicin. Řadí se mezi antracyklinová antibiotika (Huska, et al., Drummond, et al.). Primárním cílem antracyklinů je buněčná DNA. Jednou z možností účinku je interkalace (vmezeření) doxorubicinu do DNA, což vede k zastavení syntézy DNA (Box, Kellogg, et al.). Pro zvýšení účinnosti léku je potřeba co nejlépe znát jeho interakci s DNA. V naší práci je tato interakce studována pomocí elektrochemických metod. Byly studovány interakce doxorubicinu s DNA izolované z rezistentních a senzitivních buněk a hledána vzájemná korelace.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
Materiál a metody
Elektrochemie
Elektrochemické stanovení s visící rtuťovou kapkovou elektrodou (HMDE; s plochou kapky 0,4 mm2) jako pracovní elektrodou bylo provedeno pomocí přístroje AUTOLAB analyzátor (EcoChemie, Holandsko), ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Švýcarsko). Byla používána pracovní cela s tříelektrodovým zapojením. Referenční elektroda byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocná elektroda byla uhlíková tyčinka. Základní elektrolyt acetátový pufr (pH 4,6-5,0). LSV parametry: počátek a konec potenciálového okna: 0 V, a –1,65 V, potenciálový krok: 5 mV, rychlost polarizace: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 160, 320, 400, 640, 800, 1280, 2560 mV/s.
Statistická analýza
Statistická analýza byla provedena Turkeyho testem.
Biologický material
Buněčné linie IMR-32 byly získány z izolací z tkáňových buněčných kultur neuroblastomu. Pro měření byla použita DNA izolovaná z buněk senzitivních k doxorubicinu a buněk rezistentních k doxorubicinu.
Postup izolace DNA
DNA byla izolována za využití kitu Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI USA) – principem je lýza buněk, enzymatická digesce RNA, vysolení proteinů a precipitace genomické DNA isopropanolem.
Určení koncentrace DNA
Koncentrace DNA byla určena spektrofotometricky (Bio Mate™3, Hermo spectronic, Orchester NY, USA), DNA mají absorpční maximu v okolí 260 nm, molekuly proteinů v okolí 280 nm.
Výsledky a diskuse
Pro sledování interakce protinádorového léčiva doxorubicinu s DNA jsme využili elektrochemickou techniku cyklické volumetrie. Byla měřena DNA izolovaná z buněk senzitivních a rezistentních k doxorubicinu. Získali jsme charakteristický voltamogram DNA izolované z buněk. Na průběhu záznamu jsme pozorovali dva píky. První pík (1) odpovídá redukčnímu signálu cytosinu a adeninu (kolem potenciálu –1.5 V), druhý pík (2) odpovídá oxidačnímu signálu guaninu (kolem potenciálu –0.2 V). Dále jsme studovali vliv 0,1 µM a 1 µM koncentrace doxorubicinu na signál při rychlosti polarizace 1280 mV/s. DNA izolovaná jak z rezistentních tak i senzitivních buněk byla tedy měřena při různých rychlostech polarizace. Získali jsme lineární závislosti, ze kterých jsme určili směrnice přímek, které jsme porovnávali se směrnicemi kontrolního vzorku (buňky kultivované bez přítomnosti doxorubicinu). Obr. 1 a 2 ukazuje průměrné hodnoty směrnic v závislosti na koncentraci doxorubicinu pro resistentní, respektive senzitivní buňky. Na svislé ose jsou vyneseny hodnoty směrnic (k), jednotlivé sloupce odpovídají daným koncentracím. První sloupec odpovídá kontrolnímu vzorku (bez doxorubicinu). Na Obr. 1 můžeme pozorovat statistický rozdíl mezi vzorkem s koncentrací doxorubicinu 0,05 a kontrolním vzorkem. Pro ostatní koncentrace není rozdíl směrnic statisticky významný. Tím se potvrdila rezistence buněk, protože změna hodnoty průměrných směrnic se nemění v závislosti na koncentraci doxorubicinu.
Obr. 1 a 2. Porovnání průměrných hodnot směrnic s kontrolním vzorkem pro senzitivní vzorky
Závěr
Po vyhodnocení byly zjištěny rozdíly mezi směrnicí přímky senzitivních a rezistentních nádorových buněčných liniích, které jsou statisticky průkazné na hladině významnosti α = 0,05. Průměrný rozdíl hodnot směrnic přímek senzitivních a rezistentních buněk je ∆k = 0.167±0.083. Ze získaných experimentálních dat vyplívá, že elektrochemické metody jsou vhodné pro analýzu a posuzování rezistence a senzitivity buněk na protinádorová léčiva.
Literatura:
- Huska, D., et al., (2009): Square wave voltammetry as a tool for investigation of doxorubicin interactions with DNA isolated from neuroblastoma cells, Electroanalysis, 21: 487-494.
- Huska, D., et al., (2009): Electrochemical and computational study of doxorubicin interactions with DNA, FEBS J., 276: 109-109.
- Zitka, O., et al., (2008): Electroanalysis of cisplatin-glutathione and cisplatin-DNA interactions, Toxicol. Lett., 180: S133S133.
- Huska, D., et al., (2010): An electrochemical study of interaction of an anticancer alkaloid ellipticine with DNA, Chimica Oggi-Chemistry Today, 28: 15-17.
- Drummond, T. G., et al., (2003): Electrochemical DNA sensors, Nature Biotechnology, 21: 1192-1199.
- Box, V. G. S., (2007): The intercalation of DNA double helices with doxorubicin and nagalomycin, Journal of Molecular Graphics & Modelling, 26: 14-19.
- Kellogg, G. E., et al., (1998): Identification and hydropathic characterization of structural features affecting sequence specificity for doxorubicin intercalation into DNA double-stranded polynucleotides, Nucleic Acids Research, 26: 4721-4732.
*) Korespondenční autor: dalih@centrum.cz
Datum přednesení příspěvku: 21. 4. 2011
