Obsah metalothioneinu v buňkách neuroblastomu ve vztahu k rezistenci vůči platinovým cytostatikům

Úvod: Metalothioneiny(MT) jsou intracelulární, nízkomolekulární proteiny bohaté na cystein. Na základě sekvenční analýzy bylo popsáno 15 MT rodin a 38 MT podrodin. MT mají klíčovou roli při udržování homeostázy iontů kovů v organizmech. Za jejich hlavní biologickou funkci je považována detoxikace těžkých kovů. MT vyvazují ionty kovů a charakteristickým způsobem je inaktivují nebo transportují do metabolicky neaktivních kompartmentů buňky. Často diskutovanou otázkou je schopnost MT transportovat atomy kovů k apoenzymům a jejich aktivní zapojení do homeostázy esenciálních prvků. Schopnost MT transportovat kov do regulačních proteinů má význam v procesu karcinogeneze a pravděpodobně souvisí s inhibicí některých proapoptotických proteinů (p53, caspasa-3). MT se podílejí na regulaci angiogeneze (MT 1) a ovlivňují aktivitu, tzv. zinc-finger transcription factors, které jsou významné v angiogenezi, proliferaci a diferenciaci buněk.
MT snižují cytotoxicitu cisplatiny a carboplatiny neutralizací Pt iontu a experimentální studie prokazují, že zvýšená exprese metalothioneinu se u některých nádorů (ependymom, ca jícnu a ORL oblasti) může podílet na rezistenci k těmto cytostatikům, ale bylo prokázáno, že snižují účinnost i některých dalších cytostatik (etoposid, 5-fluorouracil). MT jsou také důležité látky z hlediska ochrany proti radiačnímu a oxidačnímu stresu.
Cíle: Na experimentálním modelu ověřit metodu elektrochemického vyšetření buněčného MT. Určit hladiny MT v neuroblastomové buněčné linii a od ní odvozené linie rezistentní k cisplatině a jejich změny po inkubaci s cisplatinou a karboplatinou.
Metody: Buněčná linie UKF-NB4 (připravena z recidivy neuroblastomu do kostní dřeně, s amplifikací MYCN, del1p34.2-ter, del13 iso 17q) a od ní odvozená linie UKF-NB4 ^(cddp) s in vitro navozenou rezistencí k cisplatině. Průkaz delecí a amplifikací v buněčných liniích byl proveden metodou CGH. Buněčné linie jsme kultivovali s různou koncentrací cisplatiny a karboplatiny.
Stanovení MT: Buňky byly zmraženy kapalným dusíkem a homogenizovány za přidání 1 ml fosfátového pufru (pH 6.8). Takto připravený vzorek byl inkubován při 99 °C. Takto připravené vzorky byly zředěny a analyzovány námi upraveným postupem adsorptivní přenosové techniky (AdTS) s diferenční pulzní voltametrií (DPV). na přístroji AUTOLAB Analyser (EcoChemieí) ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm) v klasickém tříelektrodovém uspořádání. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm²; referenční elektrodou byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou grafitová elektroda. Základní elektrolyt (1 mmol.dm^-3 Co(NH₃)₆Cl₃ a 1 mol.dm^-3 a amonný pufr; NH₃ (aq) + NH₄Cl, pH = 9,6) byl po každých pěti analýzách vyměněn. AdTS DPV parametry byly následující: počáteční potenciál –0,6 V, konečný potenciál –1,6 V, modulační čas 0,057 s, časový interval 0,2 s, potenciálový krok 1,05 mV/s, modulační amplituda 250 mV, E_ads = 0 V, teplota 5 °C. Jako standrad byl použit MT z králičích jater (Sigma Aldrich).
Výsledky a závěry: Ověřili jsme použitelnost elektrochemické metody pro stanovení MT v buněčných liniích. Buňky neuroblastomové linie s experimentálně navozenou rezistencí k cisplatině mají zmnožení 16q13–22, kde se nacházejí geny pro MT a neexprimují P-glykoprotein ani neamplifikují gen MDR-1 (BEDRNÍČEK et al, 2005). Tato linie je rezistentní k cisplatině i karboplatině. Inkubace po dobu pěti pasáží bez cisplatiny nesnižuje rezistenci k cisplatině ani ke karboplatině.
Buňky neuroblastomové linie rezistentní k cisplatině mají schopnost odpovídat na expozici cisplatině a karboplatině zvýšením hladin MT. Tato schopnost je u linie na cisplatině senzitivní vyjádřena podstatně méně.
Práce vznikla za podpory MŠMT VZ č. 0021620813