Nové konstrukce nanosenzorů jako nástrojů v moderní medicíně

Nanotechnologie je moderní technický obor, který se zabývá tvorbou a využíváním technologií v měřítku řádově nanometrů (109 m). Konstrukčními prvky nanotechnologie jsou molekuly a samotné atomy. Vizi nanotechnologie nastínil na konci 50. let geniální americký fyzik Richard Feynman, který představil základní myšlenky ve své slavné přednášce nazvané „Tam dole je spousta místa" (There´s Plenty of Room at the Bottom), kterou v roce 1959 přednesl na výroční schůzi Americké společnosti fyziků. Termín "nanotechnologie" ovšem definoval až v roce 1974 Norio Taniguchi, profesor Tokijské univerzity, následujícím způsobem: ´Nanotechnologie se sestává především z procesů oddělování, spojování a deformace materiálů jedním atomem, nebo molekulou.´Nanotechnologie by mohla hrát v medicíně skutečně velmi významnou roli. V nejbližších desetiletích se očekává výrazná pomoc v diagnostice, bioimplantátech a léčebných možnostech nanorobotů. Zcela autonomní nanoroboti by mohli pomáhat imunitnímu systému, podílet se na procesech látkové výměny, případně uskutečňovat operační výkony. Nanotechnologie mají potenciál pro velmi široké využití. Jednou z oblastí považovaných za nejperspektivnější je lékařská diagnostika. Předpokládá se, že v tomto oboru budou postupně vyvinuta nejrůznější zařízení od mřížek miniaturních senzorů schopných detekovat miliony nejrůznějších biologických molekul až po miniaturní křemíkové čipy schopné ´číst´ přímo jednotlivé molekuly DNA. Očekávaná schopnost těchto komponent detekovat, jak velmi různé druhy nejrůznějších molekul, tak i jejich velmi malá množství, otevírá prostor pro konstrukci miniaturních, ale velmi komplexních diagnostických zařízení. Je možné, že již během několika let se tak dočkáme komerčně dostupných technologií, které nahradí rozsáhlé a často zdlouhavé laboratorní testy jednoduchými mikročipy, které bude možno využívat ambulantně, ba i v polních podmínkách (Noginov et al.; Poland et al.; Rinker et al.; Zhang and Mao).

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Ninanodráty modifikované elektrody

Základem těchto technik je nanoporézní maska anodizovaného Al2O3 o různé velikosti nanopórů. Přes masku byl na elektrodu deponován kov a následně maska odleptána. Ninanodráty nebo nanotyčinky byly zhotoveny na tenkovrstvých elektrodách.

Elektrody byly vytvořeny na deskách křemíku, který byl opatřen 400 nm silnou izolační vrstvou SiO₂. Na této vrstvě byla vytvořena magnetofonovým naprašováním 50 nm silná vrstva titanu a následně 250-300 nm zlata. Poté byly pomocí litografické masky zhotoveny mikroelektrody leptáním kovových vrstev. Pro zhotovení nanoporézní masky byla na hotové mikroelektrody napařena vrstva 2 µm čistého hliníku. Po jeho anodizaci byl do vzniklých pórů galvanicky deponován nikl. Poté byla maska odleptána v 5 mol/l roztoku NaOH (30 °C, 4 min) a následně doleptán v 5 % roztoku H₃PO₄ (30 °C, 40 min). Po odstranění masky vznikla na elektrodách struktura zobrazena pomocí SEM (Obr. 1). Je zřejmé, že takto vytvořené nanokrystaly z různých kovů (eventuálně i jejich oxidů) mohou kvantitativně zvýšit detekční schopnosti elektrod využívaných v elektrochemických analytických metodách.



Obr. 1. Elektronmikroskopický snímek elektrodového povrchu tvořeného nanodráty z niklu.

Magnetické nanočástice

Pro potřeby separačních technik byl optimalizován proces přípravy superparamagnetických nanočástic z Fe₂O₃. Částice Fe₂O₃ byly připraveny koprecipitací, kdy k 0,05 M roztoku FeCl₂.4 H₂O byl pomalu a plynule přikapáván roztok K2CO3 (10 g/l) dokud pH nedosáhlo stabilní hodnoty blízké 7. Následně byl precipitát tepelně ošetřen. Připravené Fe₂O₃ nanočástice měly červenohnědou barvu a za pomocí vnějšího magnetického pole byly pozorovány magnetické vlastnosti. Jejich modifikace specifickými biomolekulami umožňuje jednoduchou separaci vybraných látek přímo z krevního vzorku.

Příprava a modifikace kvantových teček

Pro účely fluorescenčního zobrazování byly připraveny kvantové tečky s „core/shell" strukturou emitující elektromagnetické záření při různých vlnových délkách. Tato emise je vybuzena adsorbovaným zářením o nižších vlnových délkách, obvykle UV zářením.

Nejběžnější metodou přípravy jádra je rychlé vstříknutí polovodičového prekurzoru do horkého a intenzivně míchaného koordinačního rozpouštědla (jako je trioktylfosfin oxid (TOPO) nebo trioktylfosfin (TOP)). Koordinační rozpouštědlo stabilizuje jednak rozměr polovodiče a také zabraňuje agregaci při růstu QDs. Vytvořením slupky okolo jádra a modifikace povrchu QDs vhodnou biomolekulou zlepšuje stabilitu QDs a umožňuje navázání specifických biomolekul (proteinů).

Výsledky a diskuse

Velmi významnou skupinu nanotechnologicky a biotechnologicky využitelných materiálů představují magnetizovatelné mikro a nanočástice. V našem experimentálním výzkumu byly sledovány pomocí XRD analýzy efekty fyzikálních parametrů. Teplota sušení měla vliv na výsledné složení vzorku. Vzorek Fe₂O₃, který byl žíhán při 200 °C měl složení 22 % maghemitu/magnetitu a 78 % hematitu. Naproti tomu vzorek, který byl pouze sušen při 80 °C je tvořen z 18 % goethitu a 82 % maghemitu/magnetitu. Dalo by se říci, že při žíhání 200 °C zbylý goethit přejde na maghemit/magnetit a dříve vytvořený maghemit/magnetit přejde na hematit. Z tohoto důvodu jsme pro další výzkumy připravovaly Fe₂O₃ nanočástice sušeny při 80 °C. SEM analýzou bylo zjištěno, že velikost částic je přibližně 60 nm) (Drbohlavova et al.). V další etapě výzkumu byly magnetické nanočástice ovrstveny streptavidinem. Tento protein je velmi rozšířen v molekulární biologii kvůli své silné afinitě k vitamínu biotinu. Silná streptavidinbiotinylová vazba pak může sloužit k navázání dalších látek, proto je tato technologie využívána k detekci různých biomolekul. Přečištěné magnetické Fe₂O₃ nanočástice byly ovrstveny streptavidinem. Nejdříve byla provedena karboxylace magnetických nanočástic v etanolovém roztoku 11-merkaptoundekanové kyseliny za pomoci ultrazvuku. Následně byly karboxylované nanočástice smíchány s EDAC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N´-ethylcarbodiimid hydrochlorid) kdy s pomocí ultrazvuku při nízké teplotě došlo k aktivaci povrchu a poté byly částice smíchány se streptavidinem a ultrazvukovány při nízké teplotě. Po přečištění a odseparování byly připravené magnetické Fe₂O₃ nanočástice ovrstvené streptavidinem uchovány v PBS pufru. Magnetické mikročástice mohou být modifikovány různými molekulami schopnými specificky a selektivně zachytit biomolekuly. V průběhu řešení výzkumné etapy byl vypracován a realizován plně automatizovaný postup pro modifikaci magnetizovatelných částic nukleovými kyselinami (virové sekvence VHB, HIV, chřipka) dále separační kroky (oddělující nespecificky vázané molekuly) a kroky detekční umožňující rozpoznání přítomné sekvence. Tento postup je prováděn po naprogramování robotem (Obr. 2).

Obr. 2. Schéma robotizovaného postupu izolace nukleových kyselin anebo proteinů, založené na magnetické separaci. Mikroprocesorem řízené robotické rameno zabezpečuje přenos kapalin i nezbytných technologických nástrojů.

Vlastní redoxní detekci zachycené a posléze tepelně uvolněné nukleové kyseliny musí být věnována stálá pozornost (Hubalek et al.; Huska et al.; Huska et al.; Kukacka et al.). Soustředili jsme se na využití nově připravených nanomateriálů (především na bázi uhlíku) v konstrukci nových detekčních mikroelektrod. Podařilo se získat originální výsledky redoxních signálů DNA na detekčních elektrodách v přítomnosti uhlíkových nanotrubic. Námi navržených postupů jak izolačních, tak detekčních bylo využito v analýze reálných vzorků sér pacientů s aktivní virémií VHB (určeno real time PCR). Získané výsledky ukazují, že experimentální přístup je vhodný pro takovou detekci. Je však potřebná další optimalizace pro získání dobré korelace mezi PCR a elektrochemickou analýzou.



Obr. 3 CdSe/CdS kvantové tečky po ozáření UV světlem, kdy je pozorovatelná velmi intenzivní světelná emise.



Zcela nové možnosti v diagnostických postupech mohou přinést kvantové tečky (Drbohlavova et al.). Připravené CdSeTe/CdS kvantové tečky emitovaly v blízké infračervené oblasti. Emisní spektrum mělo docela symetrický a úzký tvar s maximem při 800 nm na rozdíl od absorpčního spektra, které bylo široké s maximem při 452 nm. Z tohoto důvodu mohly být kvantové tečky excitovány zářením s širokým rozsahem vlnových délek. Dále byly připraveny CdSe/CdS kvantové tečky, které emitovaly v UV oblasti zeleně, maximum emise měly při 504 nm. V současnosti se vedou diskuse o potenciálních rizicích mikro a především nanočástic pro živé organismy a především člověka. Byly získány experimentální výsledky ukazující toxicitu na jedné straně a na straně druhé nebyly prokázány žádné efekty. Z řady příkladů dříve používaných látek je zřejmá nutnost přistupovat k této otázce obezřetně. Námi navržený experimentální cíl si klade za úkol sledovat vliv různých nanočástic na živé buněčné kultury. V prvotních experimentech jsme se zaměřili na sledování vlivu uhlíkových nanočástic na fibroblastové kultury. Zjistili jsme, že zvýšené množství nanočástic inhibovalo buněčný růst (asi o 30 %). Větší pozornost jsme však věnovali sledování toxicity kvantových teček na suspenzi kultury tabáku. QDs, které nebyly modifikovány, působily na buňky tabáku velmi toxicky a pro případné experimenty in vivo jsou zcela nevhodné. Modifikace DQs dramaticky snižuje toxicitu. Vzhledem k našemu novému cíli využít QDs jako detektorů těžkého kovu in vitro, byly QDs modifikovány glutathionem. GSH modifikované CdSeTe/CdS kvantové tečky byly aplikovány v buněčném rostlinném modelu buňky tabáku BY-2. Byl studován efekt kademnatých iontů na buněčnou životaschopnost. Kademnaté ionty významně snižují životaschopnost buněk, protože mohou indukovat ROS (reaktivní formy kyslíku), které napadají membránu a způsobují smrt buňky. Neošetřené BY-2 buňky akumulovaly kvantové tečky na okraji buňky v cytoplazmě. Se zvyšujícím se počtem kademnatých iontů, stejně jako času působení, došlo k akumulování kvantových teček kolem jádra.

Závěr

Nanotechnologie a nanotechnologický výzkum je zatím na svém počátku s velkými technickými, technologickými i etickými překážkami. Určitě však lze očekávat, že v následujících letech budou tyto technologie stále více dostupné a aplikovatelné v biotechnologiích.

Literatura

1. Drbohlavova, J., et al., (2009): Quantum Dots - Characterization, Preparation and Usage in Biological Systems. Internatio¬nal Journal of Molecular Sciences, 10: 656-673.
   
2. Drbohlavova, J., et al., (2009): Preparation and Properties of Various Magnetic Nanoparticles. Sensors, 9: 2352-2362.
   
3. Hubalek, J., et al., 2009. New Approach in Rapid Viruses Detection and its Implementation on a Chip. IEEE Computer Soc, Conference eTELEMED 2009, Los Alamitos, p.108-112.
   
4. Huska, D., et al., (2008): Miniaturized electrochemical detector as a tool for detection of DNA amplified by PCR. Electrophoresis, 29: 4964-4971.
   
5. Huska, D., et al., (2009): Automated nucleic acids isolation using paramagnetic microparticles coupled with electrochemical detection. Talanta, 79: 402-411.
   
6. Kukacka, J., et al., (2009): Rapid isolation and detection of Hepatitis B virus by using of paramagnetic microparticles modi-fied by streptavidin. Clinical Chemistry, 55: A42-A42.
   
7. Noginov, M. A., et al., (2009): Demonstration of a spaser-based nanolaser. Nature, 460: 1110-U68.
   
8. Poland, C. A., et al., (2008): Carbon nanotubes introduced into the abdominal cavity of mice show asbestos-like pathogeni-city in a pilot study. Nature Nanotechnology, 3: 423-428.
   
9. Rinker, S., et al., (2008): Self-assembled DNAnanostructures for distance-dependent multivalent ligand-protein binding. Natu¬re Nanotechnology, 3: 418-422.
   
10. Zhang, C., Mao, C. D., (2008): DNA NANOTECHNOLOGY Bacteria as factories. Nature Nanotechnology, 3: 707-708.