NASTAVENÍ ZÁKLADNÍCH METODICKÝCH PARAMETRŮ ANALÝZY MIRNA V MOČI JAKO POTENCIÁLNÍCH BIOMARKERŮ V ONKOUROLOGII

Východiska:

Posledních pět let přitahují cirkulující miRNA pozornost výzkumníků v oblasti translační onkologie jako nové potenciální diagnostické a prognostické biomarkery. Na úrovni nádorové tkáně již byly identifikovány specifické expresní profily miRNA u řady malignit. Studium specifických profilů miRNA v tělních tekutinách představuje z tohoto hlediska novou, rychle se rozvíjející oblast onkologického výzkumu. Stále více prací se zabývá rovněž možností využití močových miRNAs jako neinvazivních diagnostických biomarkerů u urologických nádorů, které alespoň v případě nádorů ledvin a močového měchýře trpí nedostatkem spolehlivých a senzitivních biomarkerů využitelných v klinické praxi jak pro časný záchyt v primární diagnostice, tak pro monitorování onemocnění. Hlavní výhodou miRNA jako močových analytů je jejich vysoká stabilita. Dokonce i za extrémních podmínek, jako je vysoká aktivita ribonukleáz, nízká/ vysoká hodnota pH, dlouhodobé skladování vzorků při pokojové teplotě nebo opakované zamrazování a rozmrazování vzorků, si zachovávají tyto molekuly své charakteristiky a nepodléhají degradaci. Dosavadní výsledky publikované v této oblasti jsou velice slibné, ale bohužel trpí nízkou mírou reprodukovatelností především z důvodů významných rozdílů v preanalytické fázi, zpracování, archivaci vzorků moči a použitých technologiích pro kvantifikaci a normalizaci hladin močových miRNA.

Cíl:

V současnosti nejsou zodpovězeny základní otázky jako např.: (i) Se kterou frakcí moči pracovat (sediment, supernatant, exosomy)?, (ii) Je nutné pracovat s ranní močí?, (iii) Je nutné používat stabilizační činidlo? Pokud ano, jaké?, (iv) Za jak dlouho je nutné vzorek zpracovat a za jakých podmínek musí být krátkodobě či dlouhodobě uchováván?, (v) MiRNA se ve vzorcích vyskytují ve velmi nízkých koncentracích – jaký je nejvhodnější způsob jejich kvantifikace?, (vi) Jaká je nejvhodnější endogenní kontrola pro normalizaci naměřených hladin miRNA? Dosud publikované práce se těmito zcela klíčovými otázkami bohužel zabývaly pouze okrajově. Cílem naší studie je definování optimálních podmínek pro odběr, zpracování a archivaci moči určené pro analýzu miRNA a dále nastavení standardního protokolu pro kvantifikaci miRNA v moči a reprodukovatelné stanovení jejich hladin jako potenciálních biomarkerů. Naši metodiku ověřujeme na modelu renálního karcinomu a karcinomu močového měchýře, přičemž srovnáváme hladiny miR-21 a miR-125b v moči nemocných a nenádorových kontrol.

Závěr:

Výsledky naší studie budou součástí sdělení.

Tato studie byla podpořena grantem IGA MZČR NT13547-4/ 2012.