Konference: 2015 XXXIX. Brněnské onkologické dny a XXIX. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: XXX. Základní a aplikovaný výzkum v onkologii
Číslo abstraktu: XXX/ 156
Autoři: RNDr. Lucie Benešová, Ph.D.; Barbora Belšánová; Mgr. Tereza Hálková; MUDr. Vlada Melniková, Ph.D.; as. MUDr. Miroslav Levý, Ph.D., MBA; doc.MUDr. Ludmila Lipská, Ph.D.; prof. MUDr. Miloš Pešek, CSc.; MUDr. Ondřej Fiala; MUDr. Jiří Pudil; MUDr. Petra Mináriková, Ph.D.; plk. prof.MUDr. Miroslav Zavoral, Ph.D.; prof. MUDr. Miroslav Ryska, CSc.; RNDr. Marek Minárik, Ph.D.; Mark G. Erlander, M.D.
Východiska:
Detekce cirkulující nádorové DNA (ctDNA), nazývaná také „tekutá biopsie“ (liquid biopsy), se stává nadějným nástrojem pro neinvazivní monitoring pacientů. Metodiky vyšetřování ctDNA jsou zpravidla založené na citlivé platformě digitální PCR s limitem detekce nižším než 0,01 % mutovaných alel, avšak jsou finančně i časově náročné. Kromě plazmy se pro vyšetření ctDNA v poslední době stává objektem zájmu také moč, zejména z důvodu neinvazivity. Cílem této práce bylo zavést jednoduchou, levnou, ale citlivou metodu detekce ctDNA v plazmě pro užití v rutinní praxi a ověřit její funkčnost na pacientech s kolorektálním karcinomem (CRC), nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC) a karcinomem pankreatu (PC). Dalším cílem bylo za použití speciální platformy stanovit hladiny ctDNA v moči a korelovat je s hladinami v plazmě.
Materiál a metody:
Celkem jsme do studie zahrnuli 362 pacientů s CRC (251), PC (85) a NSCLC (26) představujících 733 vzorků plazmy. Vzorky jsme vyšetřili na přítomnost mutace protoonkogenů (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA a EGFR) nebo tumor supresorů (TP53, APC a CTNNB1) za použití denaturační kapilární elektroforézy (DCE). U podskupiny 20 pacientů operovaných pro pokročilý CRC, kde byly hladiny ctDNA monitorované před operací a po ní a následně pak ve 2–6měsíčních intervalech, jsme tato data korelovali s výsledky získanými vyšetřením plazmy a moči za použití hlubokého sekvenování nové generace (NGS) s prekoncentrací mutovaných fragmentů.
Výsledky:
Celkový záchyt ctDNA v plazmě pacientů s pokročilým CRC metodou DCE je 68 % ve srovnání s uváděnými hodnotami cca 88 % metodami na principu dPCR. Minimální vstupní koncentrace DNA je 5 pg a hodnota LOD odpovídá 0,03–1 % v závislosti na testovaném genu. Při srovnání 85 vzorků plazmy vyšetřených metodou DCE a hlubokého NGS jsme zaznamenali shodu u 69 (81 %) vzorků (37krát pozitivní, 32krát negativní) a neshodu u 16 (19 %) vzorků (15krát DCE negativní a NGS pozitivních a 1krát DCE pozitivní a NGS negativní). Ve všech 15 případech falešné negativity u metody DCE šlo o vzorky s hladinou ctDNA menší než 850 molekul cílové sekvence. Korelace ctDNA pozitivity plazmy a moči byla vyhodnocena u celkem 18 vzorků se shodou u 16 (89 %) vzorků, kdy u dvou neshodných vzorků byla plazma ctDNA pozitivní a moč negativní.
Závěr:
Naše rutinně používaná metodika je dostatečná pro vyšetřování ctDNA v plazmě většiny pacientů s metastatickým CRC. Nově zaváděná metodika vykazující výrazně vyšší náklady a technologické nároky (dPCR, NGS) má tak především využití pro detekci ctDNA v moči.
Podpořeno grantem IGA MZ NS13660.
Datum přednesení příspěvku: 9. 4. 2015
