Mutační status genu K-ras u kolorektálního karcinomu: metodika používaná na MOÚ s výsledky.

Gen k-ras patří do rodiny ras protoonkogenů kódující G-protein, který je součástí signální dráhy EGFR (receptor pro epidermální růstový faktor). U různých typů nádorů byly identifikovány mutace genu K-ras vedoucí k porušené GTPázové aktivitě K-ras proteinu, jejímž výsledkem je neschopnost inaktivace tohoto G-proteinu a konstitutivní aktivace K-ras-indukovaných signálních drah spojených např. s podporou proliferace buněk a potlačením apoptózy.

Pro léčbu metastatického kolorektálního karcinomu se v posledních letech objevuje možnost biologické léčby pomocí anti-EGFR protilátek (panitumumab, cetuximab) inhibující signální dráhy spuštěné tímto receptorem. Mutace v genu k-ras vedoucí k jeho trvalé aktivaci, ho činní nezávislým na aktivaci EGFR receptorem, a proto i blokování tohoto receptoru pomocí cílené léčby nemá z biologického hlediska význam. Tento předpoklad se již potvrdil i v mnoha klinických pozorováních. Přítomnost aktivačních mutací v genu k-ras v buňkách kolorektálního karcinomu je spojen s výrazně horší odpovědí pacientů na léčbu anti-EGFR protilátkami. Vyšetření mutačního statutu genu k-ras se proto stalo součástí preskripčních doporučení, a později i omezení pro indikaci anti-EGFR biologické léčby u pacientů s kolorektálním karcinomem.

Pro vyšetření mutačního statutu genu k-ras používáme standardizovaný postup TheraScreen (Roche), který umožňuje detekci 7 aktivačních bodových mutací (6 mutací v kodonu 12 a 1 mutaci v kodonu 13) metodou kvantitativní PCR s primery selektivními pro konkrétní mutované sekvence. Podle údajů výrobce je daným postupem možné zachytit mutaci i v případě, že je přítomna pouze v 1% buněk vstupujících do analýzy, což metodu z hlediska senzitivity výrazně zvýhodňuje oproti alternativním postupům založeným na sekvenačních metodách. Citlivost záchytu mutací se snižuje se zhoršující se kvalitou izolovaného templátu. Vzhledem k typu vyšetřovaného materiálu (resekce tumoru a jeho histologické zpracovaní proběhlo mimo MOÚ, tkáň archivovaná před několika lety) bylo nutné přizpůsobit metodiku vyšetření pro biologický materiál fixovaný formalínem a zalitý v parafinových blocích. Při indikaci vyšetření je patologem určena oblast, ve které se v bločku nachází nádorová tkáň, z níž je vyjmuto 3-5 mg materiálu, který je skalpelem rozkrájen na drobné kousky. Tkáň je následně odparafínovaná xylenem, etanolem a po osušení převedena do lyzačního pufru s proteinázou K a lyzována přes noc při 55°C. DNA je izolována ze získaného tkáňového lyzátu systémem MagNA Pure Compact (Roche) protokolem pro tkáně s elucí do velkého objemu (200 mikroL). Do reakce je použito 5 mikroL získaného izolátu DNA. Amplifikační reakce se provádí na přístroji LightCycler 480 (Roche). Při převedení izolačního kroku z kolonkové metody na magnetickou separaci se nám zvýšila výtěžnost stanovení. Celkově bylo z doposud provedených 83 vyšetření mutačního statutu genu k-ras z nádorové tkáně v parafínových bločcích 95% výtěžných. Wild-type status byl určen u 48 vzorků tj. 61%. Jednotlivé mutace byly zachyceny s následující četností Glyl2Ala-6%, Gly12As-45%, Gly12Arg-6%, Gly12Cys-10%, Gly12Ser-13%, Gly12Val-16%, Gly13Asp-3%.

Práce byla podpořena grantem Ministerstva zdravotnictví číslo MZ000209805.