Multifunkční imunomodulační proteiny HLA-E a HLA-G v klasickém Hodgkinově lymfomu: potenciální význam.

   Hodgkinův lymfom je označení pro dvě samostatné nádorové entity: nodulární Hodgkinův lymfom s převahou (predominancí) lymfocytů a klasický Hodgkinův lymfom (s podtypy nodulární skleróza, smíšená buněčnost, bohatý na lymfocyty a chudý na lymfocyty).

   Nodulární Hodgkinův lymfom s převahou (predominancí) lymfocytů je B lymfoproliferace charakterizovaná nodulární či nodulární a difúzní proliferací roztroušených velkých neoplastických buněk se zprohýbanými laločnatými jádry, které se označují jako “popcorn“ či LP buňky (lymphocyte predominant, dříve rovněž lymfohistiocytární buňky, L&H buňky). Tyto buňky jeví pozitivitu na B markery (CD 20) a jsou negativní na CD 30 a negativní na CD 15. V pozadí je smíšeně reaktivní celulizace s převahou malých lymfocytů B linie.

   Klasický Hodgkinův lymfom je lymfoproliferace ve většině případů B linie, charakterizovaná tzv. diagnostickými RS (Reedové-Sternbergovými) buňkami s charakteristickými dvěma zrcadlově protilehlými vezikulárními jádry s výraznou jadernou membránou, bledým chromatinem a (dvěma) nápadnými eozinofilními jadérky. Nediagnostické varianty neoplastických buněk jsou Hodgkinovy buňky, lakunární buňky a Sternbergovy buňky. Neoplastické buňky Hodgkinova lymfomu jeví membránovou a Golgi aparát pozitivitu na CD 30, mohou jevit pozitivitu na CD 15 a zpravidla jsou negativní na B i T lymfocytární markery (některé B markery mohou být slabě pozitivní) a společný leukocytární antigen. V pozadí jsou přítomny různé reaktivní buňky dle podtypu klasického Hodgkinova lymfomu, jmenovitě u podtypu nodulární sklerózy je přítomna převaha lymfocytů, ale s přítomností nečetných granulocytů, u podtypu smíšené buněčnosti je v pozadí přítomna směs různých leukocytů a fibroblastů, u podtypu bohatého na lymfocyty jsou přítomny téměř výhradně malé polyklonální lymfocyty (převážně T linie) a u podtypu chudého na lymfocyty je lymfocytů malé množství.

   Původně popsaná role imunomodulatorních neklasických molekul HLA-G a HLA-E byla limitována na participaci v indukci tolerance a následné akceptaci fetálního semiallograftu počátkem těhotenství. O možné roli exprese HLA-G a HLA-E v protinádorové odpovědi a rozvoji Hodgkinova lymfomu dosud existují pouze limitované údaje.

    Cíl

   Cílem autora bylo zhodnocení exprese HLA-E i HLAE ve tkáních klasického Hodgkinova lymfomu, a to jak buňkami v reaktivním pozadí (konkrétně lymfocyty), tak neoplastickými buňkami samotnými (RS buňkami, Hodgkinovými buňkami, lakunárními buňkami a Sternbergovými buňkami). Použitá metodika (imunohistochemická mikroskopická semikvantitativní analýza) umožnila výhodné oddělené hodnocení exprese molekul v obou komponentách tumoru.

   Materiál a metodika

   Bylo analyzováno 40 případů klasického Hodgkinova lymfomu. Soubor zahrnoval 2 případy podtypu bohatého na lymfocyty, 25 případů podtypu nodulání sklerózy, 12 případů podtypu smíšené buněčnosti a jeden případ podtypu lymfocytární deplece. Věk pacientů byl v intervalu čtyři až 68 let s průměrným věkem 26,5 let, 22 mužů a 18 žen. Dva pacienti byli klinické stadium IA, žádný pacient nebyl klinické stadium IB, 11 pacientů bylo klinické stadium IIA, 11 pacientů bylo klinické stadium IIB, čtyři pacienti byli klinické stadium IIIA, 7 pacientů bylo klinické stadium IIIB, dva případy byly klinické stadium IVA a tři případy byly klinické stadium IVB.

   Pro immunohistochemickou analýzu exprese byly použity protilátky HLA-G (izoforma G1, klon MEM-G/2, ředění 1:40, Exbio Praha) a HLA-E (klon MEM-E/02, ředění 1:25, Exbio Praha).

   Hodnocení a výsledky

   Pro účely statistického hodnocení, exprese byla hodnocena jako 1 (buňky negativní) 2 (buňky fokálně/regionálně pozitivní) a 3 (buňky difúzně pozitivní). Rozhraní bylo stanoveno mezi skupinou 1 a skupinami 2 + 3, tedy negativitou a pozitivitou jakékoliv intenzity či distribuce, čímž se eliminoval potenciální vliv subjektivity v semikvantitativním hodnocení imunohistochemických barvení.

   Zjistili jsme expresi HLA-G neoplastickými buňkami ve 22 případech (55 %) a expresi reaktivními lymfocyty v pozadím 21 případech (52,5 %). 13 případů (32,5 %) bylo pozitivních na expresi v obou populacích buněk (nádorových i reaktivních), naopak 3 případy (7,5 %) byly negativní v obou populacích buněk. Zjistili jsme expresi HLA-E neoplastickými buňkami ve 28 případech (70 %) a expresi reaktivními lymfocyty v pozadí ve 25 případech (62,5 %). 15 případů (37,5 %) bylo pozitivních na expresi v obou populacích buněk (nádorových i reaktivních), naopak 4 případy (10 %) byly negativní v obou populacích buněk.

   Statistická analýza

  Byla nalezena pozitivní korelace mezi expresí HLA-E neoplastickými buňkami a klinickým stadiem: p= 0, 0197 jednosměrným ANOVA testem a p= 0,0086 prostřednictvím neparametrického Kruskal-Wallisova testu.

   Vztah mezi expresí HLA-E buňkami reaktivního pozadí a klinickým stadiem se zdá být prognosticky neutrální (p= 0,28 jednosměrným ANOVA testem and p= 0,67 prostřednictvím neparametrického Kruskal-Wallisova testu), stejně tak jako vztah exprese HLA-E v neoplastických buňkách reaktivního pozadí (p=0,81 jednosměrným ANOVA testem a p= 0,81 prostřednictvím neparametrického Kruskal-Wallisova testu).

   Diskuse

   V naší studii jsme podruhé literatuře (1) popsali že molekula HLA-G je u klasického Hodgkinova lymfomu exprimována většinou neoplastických buněk a menšinou lymfocytů v reaktivním infiltrátu pozadí, ale žádná statistická korelace nebyla nalezena jak pro nádorové buňky, tak pro nenádorové lymfocyty v pozadí.

   V naší studii jsme popsali poprvé že molekula HLA-E je u klasického Hodgkinova lymfomu exprimována většinou neoplastických buněk a že tato exprese koreluje s klinickým stadiem choroby. Žádná korelace nebyla nalezena pro nenádorové lymfocyty v pozadí, ve kterých byla tato molekula identifikována v mešině případů. Rovněž jsme nenalezli korelaci mezi expresí HLA-E neoplastickými buňkami a buňkami reaktivního pozadí.

   Statisticky významná korelace mezi expresí HLA-E a klinickým stadiem je velmi zajímavá, vzhledem k tomu, že tento typ lymfomu se obvykle v těle šíří pozoruhodně předvídatelným sukcesívním způsobem: postižení lymfatických uzlin obecně předchází před postižením sleziny, po infiltraci sleziny jsou postižena játra a finálně je přítomna infiltrace kostní dřeně a dalších orgánů. Inhibiční role HLA-E (a dalších imunomodulačních molekul) v překonávání počáteční obrany hostitele proti tumoru interferencí s cytotoxickým účinkem NK/T buněk je obecně známá a všeobecně akceptovaná. Již méně je známo o roli těchto imunomodulačních molekul v lokoregionálním šíření tumorů a/nebo v metastatických procesech. Šíření tumorů a proces metastázování byl již extenzívně prostudován ze spíše mechanicistického hlediska (viz např. množství literárních údajů které se objevilo v posledních letech o šíření usnadňující roli matrixových metaloproteináz), ale mnohem méně je známo o roli lokálního imunitního mikroprostředí. Pozorovaná přítomnost HLA-E na lymfocytech reaktivního pozadí může znamenat pokus hostitelského imunitního dozoru o využití defenzívních aktivačních odpovědí této multifunkční molekuly (tedy využití těchto molekul jako imunoaktivačních ligand pro CD94/NKG2C). Jelikož je ale dostatečně známo, že NK buněk je v reaktivním infiltrátu u klasického Hodgkinova lymfomu poměrně málo (a zároveň je u pacientů přítomna systémová deficience NK buněk), tato spekulativní imunitně aktivační obrana by musela bát uskutečněna cestou CD 8+ T lymfocytů prezentací „nekánonických“ peptidů, např. ze stresových či s patogenem souvisejících (odvozených od Epstein-Barrové virů?) proteinů, či proteinů pocházejících z nádorových buněk. Bylo zjištěno, že in vitro HLA-E-restriktivní CD8+ T-lymfocyty mohou rozeznat a usmrtit fibroblasty infikované lidským cytomegalovirem (2). Podobně lze spekulovat, že HLA-E-restriktivní CD8+ T lymfocyty mohou reprezentovat další typ efektorových buněk které hrají roli v obraně proti Epstein-Barrové virům a které mohou potenciálně uniknout rozpo- znání cytolytickými T lymfocyty restriktivními klasickými HLA molekulami a NK buňkami. HLA-E-restriktivní cytolytické T lymfocyty vykazují širokou cytolytickou aktivitu proti nejrůznějším HLA-E+ allogeneickým liniím nádorových buněk patřících k různým histotypům (funkce označovaná jako NK-like aktivita) (3). Vzhledem k tomu, že cytolytické CD 8+ T lymfocyty reprezentují – všeobecně – pouze minoritní populaci lymfocytární T linie v populaci reaktivního pozadí (4), efektivita tohoto obranného mechanizmu by byla pravděpodobně malá, což je v souladu s naším pozorováním prognosticky neutrálních statistických korelací pokud se týče buněk reaktivního pozadí. Naše výsledky tedy ukazují, že i když je exprese multifunkčního imunomodulačního HLA-E proteinu u klasického Hodgkinova lymfomu přítomna jak v neoplastických buňkách, tak v lymfocytech reaktivního pozadí, vliv exprese této molekuly je vyblancován směrem k podpoře šíření nádorových buněk. Protein HLA-E, produkovaný neoplastickými buňkami klasického Hodgkinova lymfomu tedy pravděpodobně působí jako liganda pro imunosupresivní receptory CD94/NKG2A a tímto mechanismem může nádorovým buňkám pomoci uniknout imunitními dozoru hostitele, a to jak v místě primárního vzniku malignity, tak v místech následného šíření, což je v souladu s naším pozorováním prognosticky významné pozitivní korelace s klinickým stadiem choroby. Význam exprese HLA-G v nádorových buňkách a význam exprese HLA-G i HLA-E v nenádorových lymfocytech reaktivního pozadí se jeví prognosticky neurální a zasluhuje další studium, nejlépe na větším souboru pacientů.

   Část výsledků přednášky byla recentně publikována v Pathology Research and Practice, 2012, 208:45-49.

Literatura

1.  Diepstra A, Poppema S, Boot M et al. HLA-G protein expression as a potential immune escape mechanism in classical Hodgkin's lymphoma. Tissue Antigens 71:219-226, 2008.

2.  Mazzarino P, Pietra G, Vacca P et al. Identification of effectormemory CMV-specific T lymphocytes that kill CMV- infected target cells in an HLA-E-restricted fashion. Eur J Immunol 35:3240–3247, 2005.

3.  Mingari MC, Vitale C, Cambiaggi A et al. Cytolytic T lymphocytes displaying natural killer (NK)-like activity: expression of NK-related functional receptors for HLA class I molecules (p58 and CD94) and inhibitory effect on the TCR-mediated target cell lysis or lymphokine production. Int Immunol 7: 697–703, 1995.

4.  Alvaro-Naranjo T, Lejeune M, Salvadó-Usach MT et al. Tumor-infiltrating cells as a prognostic factor in Hodgkin's lymphoma: a quantitative tissue microarray study in a large retrospective cohort of 267 patients. Leuk. Lymphoma, 46:1581-1591,2005.