Konference: 2006 XXX. Brněnské onkologické dny a XX. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: Nové nádorové markery a prediktory
Číslo abstraktu: 183p
Autoři: RNDr. Libor Hanák, PhD.; Mgr. Arnošt Kostečka; I. Němečková
Metodika
V MOÚ Brno byl cytotoxický test zaváděn a optimalizován v průběhu roku 2003 za účelem klinického využití. Plně rutinní podoby nabyl od počátku roku 2004, kdy začal být účtován na pojišťovnu a kdy byla zavedena zpětná verifikace vzorků pomocí cytospinového barvení. Namísto klasického MTT je však používána reagencie WST-1 (Roche), kdy tento načervenalý solubilní (4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benze n disulfonát je redukován na rozpustný formazan (temně červenohnědý). Reakce probíhá opět na mitochondriální membráně živých buněk. Zabarvení formazanu se vyhodnocuje spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm. Hodnota absorbance roztoku odpovídá množství živých buněk (čím tmavší barva a tedy vyšší absorbance, tím vyšší procento živých buněk). Použití WST-1 metodu zjednodušuje a urychluje, celý reakční mechanismus probíhá pouze ve vodném prostředí. Stejně jako u klasického testu s MTT i zde vyšetřovaný nádor je považován za rezistentní, jestliže jeho kultivované buňky přežívají (nadále vykazují metabolickou aktivitu na mitochondriální membráně) z více než 50%.
Výsledky
V Laboratoři chemorezistence je cytotoxickým testem vyšetřována široká škála solidních tumorů:
kolorekta, mammy, ovária, renální, maligního melanomu, ventrikulu, sarkomu, anu, histiocytomu, pankreatu, močového měchýře, dělohy, jícnu, testikulární, ureteru, prostaty, penisu, žlučníku, nadledvin, hrtanu. Celkový přehled práce za tříleté období provádění testu uvádí následující tabulka:
Vysvětlivky:
nehodnoceno celkový počet přijatých vzorků a z toho nevyšetřených z důvodu výtěžnosti nedostatečného množství buněk nebo že buňky nepřežily dobu kultivace či kontaminace kultury výtěžnost (%) počet úspěšně kultivovaných vzorků z celkového počtu za dané období vyjádřeno v %.
Je zřejmé, že nemalá část přijatých vzorků po zpracování nemohla být pro nedostatek buněk (potřeba 1 milionu buněk na každé cytostatikum) testována. Lepší bilance výtěžnosti v roce 2003 (85,6 %) je možné přičíst přísunu limitovaného počtu vzorků z patologie bohatých na množství nádorové tkáně.
K častějším vzorkům, které byly podrobeny MTT testu náleží nádory kolorekta, ovárií, mammy, ledvin, maligního melanomu, sarkomu a ventrikulu, zde je patrná nižší výtěžnost živých buněk u nádorů mammy, sarkomu, ale i kolorekta, podobně je i více případů, kdy vzorek je rezistentní na všechna testovaná cytostatika, nejčastěji u kolorekta:
Vysvětlivky:
Závěr
Metodika MTT testů začala být používána v rámci MOÚ Brno před třemi lety, přičemž dva roky je již ve fázi rutinního provozu jako jeden z prediktivních nástrojů, které mají naši klinici k dispozici při rozhodování o léčbě pacienta. Jak již bylo naznačeno, omezením této metody jsou v zásadě dva faktory. Jedním je omezená výtěžnost živých nádorových buněk z resekátu vyoperovaného nádoru, který se dá jen těžko ovlivnit. Druhý faktor se týká úspěšně kultivovaných vzorků, kdy přítomnost vysokého procenta normálních buněk v kultuře může mít za následek posun výsledku MTT testu směrem k „falešné rezistenci“. To je řešeno posouzením reprezentativnosti vzorků pomocí cytospinového barvení.
Literatura
V MOÚ Brno byl cytotoxický test zaváděn a optimalizován v průběhu roku 2003 za účelem klinického využití. Plně rutinní podoby nabyl od počátku roku 2004, kdy začal být účtován na pojišťovnu a kdy byla zavedena zpětná verifikace vzorků pomocí cytospinového barvení. Namísto klasického MTT je však používána reagencie WST-1 (Roche), kdy tento načervenalý solubilní (4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benze n disulfonát je redukován na rozpustný formazan (temně červenohnědý). Reakce probíhá opět na mitochondriální membráně živých buněk. Zabarvení formazanu se vyhodnocuje spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm. Hodnota absorbance roztoku odpovídá množství živých buněk (čím tmavší barva a tedy vyšší absorbance, tím vyšší procento živých buněk). Použití WST-1 metodu zjednodušuje a urychluje, celý reakční mechanismus probíhá pouze ve vodném prostředí. Stejně jako u klasického testu s MTT i zde vyšetřovaný nádor je považován za rezistentní, jestliže jeho kultivované buňky přežívají (nadále vykazují metabolickou aktivitu na mitochondriální membráně) z více než 50%.
Výsledky
V Laboratoři chemorezistence je cytotoxickým testem vyšetřována široká škála solidních tumorů:
kolorekta, mammy, ovária, renální, maligního melanomu, ventrikulu, sarkomu, anu, histiocytomu, pankreatu, močového měchýře, dělohy, jícnu, testikulární, ureteru, prostaty, penisu, žlučníku, nadledvin, hrtanu. Celkový přehled práce za tříleté období provádění testu uvádí následující tabulka:
Vysvětlivky:
nehodnoceno celkový počet přijatých vzorků a z toho nevyšetřených z důvodu výtěžnosti nedostatečného množství buněk nebo že buňky nepřežily dobu kultivace či kontaminace kultury výtěžnost (%) počet úspěšně kultivovaných vzorků z celkového počtu za dané období vyjádřeno v %.
Je zřejmé, že nemalá část přijatých vzorků po zpracování nemohla být pro nedostatek buněk (potřeba 1 milionu buněk na každé cytostatikum) testována. Lepší bilance výtěžnosti v roce 2003 (85,6 %) je možné přičíst přísunu limitovaného počtu vzorků z patologie bohatých na množství nádorové tkáně.
K častějším vzorkům, které byly podrobeny MTT testu náleží nádory kolorekta, ovárií, mammy, ledvin, maligního melanomu, sarkomu a ventrikulu, zde je patrná nižší výtěžnost živých buněk u nádorů mammy, sarkomu, ale i kolorekta, podobně je i více případů, kdy vzorek je rezistentní na všechna testovaná cytostatika, nejčastěji u kolorekta:
Vysvětlivky:
- lokalizace primárního tumoru
- celkový počet přijatých vzorků a z toho nevyšetřených z důvodu
výtěžnosti nedostatečného množství buněk nebo že buňky nepřežily
dobu kultivace či kontaminace kultury
- z úspěšně kultivovaných vzorků kolik bylo nasazeno na 1-2
cytostatika
- z úspěšně kultivovaných vzorků kolik bylo rezistentních a kolik
citlivých na 1-2 či více cytostatik
- počet cytostatik testovaných u daného typu tumoru
Závěr
Metodika MTT testů začala být používána v rámci MOÚ Brno před třemi lety, přičemž dva roky je již ve fázi rutinního provozu jako jeden z prediktivních nástrojů, které mají naši klinici k dispozici při rozhodování o léčbě pacienta. Jak již bylo naznačeno, omezením této metody jsou v zásadě dva faktory. Jedním je omezená výtěžnost živých nádorových buněk z resekátu vyoperovaného nádoru, který se dá jen těžko ovlivnit. Druhý faktor se týká úspěšně kultivovaných vzorků, kdy přítomnost vysokého procenta normálních buněk v kultuře může mít za následek posun výsledku MTT testu směrem k „falešné rezistenci“. To je řešeno posouzením reprezentativnosti vzorků pomocí cytospinového barvení.
Literatura
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J
Immunol Methods. 65: 55-63, 1983.
- Denizot, F. and Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell
growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure
giving improved sensitivity and reliability, J Immunol Methods. 89:
271-7, 1986.
- Furukawa, T., Kubota, T., Suto, A., Takahara, T., Yamaguchi,
H., Takeuchi, T., Kase, S., Kodaira, S., Ishibiki, K., and
Kitajima, M. Clinical usefulness of chemosensitivity testing using
the MTT assay, J Surg Oncol. 48: 188-93, 1991.
- Saikawa, Y., Kubota, T., Furukawa, T., Suto, A., Watanabe, M.,
Kumai, K., Ishibiki, K., and Kitajima, M. Single-cell suspension
assay with an MTT end point is useful for evaluating the optimal
adjuvant chemotherapy for advanced gastric cancer, Jpn J Cancer
Res. 85: 762-5, 1994.
- Suto, A., Kubota, T., Shimoyama, Y., Ishibiki, K., and Abe, O.
MTT assay with reference to the clinical effect of chemotherapy, J
Surg Oncol. 42: 28-32, 1989.
- Yamaguche, H., Tanimura, H., Nakamori, M., Noguchi, K.,
Iwahashi, M., Tani, M., Hotta, T., Murakami, K., and Ishimoto, K.
Clinical evaluation of chemosensitivity testing for patients with
colorectal cancer using MTT assay, Dis Colon Rectum. 39: 416-22,
1996.
- Berridge MV et al.: The Biochemical and Cellular Basis of Cell Proliferation Assays That Use Tetrazolium Salts, Biochemica 4: 15-19, 1996
Datum přednesení příspěvku: 11. 5. 2006
