Možnosti genetického testování a metylační analýzy cirkulující volné nádorové DNA (tumor cell-free DNA) izolované z periferní krve nemocných NSCLC.

   Úvod

   Nemocní s pokročilými stádii zhoubných novotvarů mívají často zvýšené hladiny cirkulující volné DNA (cell-free DNA, cfDNA) v periferní krvi. K uvolňování cfDNA dochází v důsledku aktivace procesů buněčné apoptózy a nekrózy, a to jak přímo z masy tumoru, tak i z okolní nenádorové tkáně. Z hlediska diagnosticko-terapeutického postupu je z celkové cfDNA významná především složka nádorová, tzv. tumorová cfDNA. Ideálním indikátorem přítomnosti této složky je výskyt somatických mutací, které jsou pro primární nádor charakteristické, v případě karcinomu plic jsou to např. mutace genů EGFR nebo KRAS. Přítomnost tumorové cfDNA může usnadnit získání DNA materiálu pro molekulární profilaci tumoru za účelem diagnostiky a predikce léčebné odpovědi biologické cílené léčby. To vše bez nutnosti provádění invazivních vyšetření zaměřených na cílenou biopsii často nesnadno dostupného novotvaru. V tomto projektu jsme se zaměřovali na vyhledávání nemocných s přítomností cfDNA a následné provádění vyšetření sady epigenetických markerů souvisejících s biologickým chováním nádoru.

   Metodika

   U všech pacientů ze studovaného souboru s klinicky verifikovanou diagnózou NSCLC byl proveden odběr tumorózní tkáně a současně i odběr periferní nesrážlivé krve, ze které byla ihned izolována krevní plasma. Ve vzorcích tkání byla vyšetřována přítomnost mutací KRAS a EGFR. U pacientů s nalezenou mutací bylo též provedeno metylační vyšetření ve tkáni, ze vzorku plazmy byla extrahována cfDNA a provedeno vyšetření přítomnosti dané mutace v cfDNA (detekce tumorové složky). V tumorové cfDNA bylo provedeno metylační vyšetření panelu 30ti vybraných genů.

   Veškeré mutační analýzy byly prováděny metodou denaturační kapilární elektroforézy (DCE) na standardním DNA sekvenátoru ABI3100 s použitím kitů Genoscan KRAS a Genoscan EGFR. Metylační vyšetření byla prováděna metodou MLPA.

  Výsledky

   Z celkového počtu 107 pacientů ve studii byla některá z mutací EGFR nebo KRAS nalezena u 26ti pacientů (14 x EGFR, 12 x KRAS). Z tohoto počtu byla přítomnost tumorové cfDNA detekována v plazmě 8mi pacientů, u kterých bylo následně provedeno metylační vyšetření. Při srovnání metylačních profilů primárních nádorů a tumorové cfDNA byla nejčastěji zjištěna shoda u genů VHL (4/8, 50 %), APC (3/8, 37 %), PTEN (3/8, 37 %), CASP8 (3/8, 37 %) a TIMP3 (3/8, 37 %). U každého ze sledovaných pacientů byla hypermetylace v primárním nádoru alespoň u jednoho z postižených genů následně prokázána i v tumorové cfDNA.

   Závěr

   Výsledky naší pilotní studie dokládají možnost využití volné DNA v periferní krvi nejen pro vyšetření přítomnosti mutací genu EGFR a KRAS, ale i pro vyšetření metylačního statusu genů významných pro biologické chování nemalobuněčného karcinomu. Mutace genu EGFR a KRAS posloužily v této studii jako marker přítomnosti nádorové DNA v periferní krvi.

Tento projekt byl podpořen grantem IGA MZ ČR NS9718-4.