Molekulární podstata toxicity fluoropyrimidinů u onkologických pacientů

5-fluorouracil (5-FU) a jeho prekurzory (kapecitabin, tegafur) patří mezi nejpoužívanější protinádorová chemoterapeutika. Jsou indikována v léčbě solidních nádorů, zejména kolorektálního karcinomu, karcinomu žaludku, jater, pankreatu, prsu, hlavy a krku. Jedním z limitujících omezení úspěšné léčby fluoropyrimidiny jsou projevy závažné toxicity doprovázející aplikaci těchto chemoterapeutik u nemalé skupiny onkologických pacientů (5–15%). Mezi klasické symptomy toxicity náleží mukositida, průjmy a neutropenie. V současnosti se jako příčina těchto komplikací označuje nedostatečná aktivita dihydropyrimidindehydrogenázy (DPD; EC 1.3.1.2), enzymu katalyzujícímu první a zároveň rychlost určující krok degradační kaskády 5-FU. Metabolizmus 5-FU probíhá majoritně v játrech. Účinkem DPD vytvořený 5,6dihydrofluorouracil je substrátem dihydropyrimidinázy (DPYS; EC 3.5.2.2) hydrolyzující pyrimidinový skelet na 5-fluoroureido-propionát, jež je v posledním kroku ß-ureidopropionázou přeměněn na fluoro-ß-alanin.
Cílem práce je charakterizace molekulárně biologických prediktorů cytotoxicity po podání 5-FU. Pacienti zahrnutí do studie byli vybráni ošetřujícím lékařem na základě výskytu závažné toxicity po podání fluoropyrimidinů (Grade III-IV, NCIC CTC). Genetický materiál neselektované nenádorové populace a pacientů s dobrou tolerancí léčby 5FU (Grade 0-I) pochází z DNA banky pracoviště. DNA a celková RNA byly získány z periferní krve užitím izolačních kitů. Komplementární cDNA byla připravena pomocí Superscript III (Invitrogen). Pro analýzu změn v kódující sekvenci genu DPD byla u pacientů s toxicitou cDNA amplifikována s primery ve třech vzájemně se překrývajících fragmentech. PCR amplikony byly následně sekvenovány s BigDye Terminator ver.3.1 (Applied Biosystems). K mutační analýze genu DPYS byly amplifikované exonové oblasti analyzovány metodou DHPLC (WAVE3500, Transgenomic). U souboru 10 pacientů s toxicitou (Grade IV) a 10 kontrolních pacientů s dobrou tolerancí léčby (Grade 0-I) byla pomocí expresních mikroarrayí (Superarray) stanovena genová exprese 263 genů participujících na metabolizaci farmak a rozvoji lékové toxicity.
Výsledky mutační analýzy genu DPD shrnuje tabulka 1.



V rámci sekvenace amplikonů mRNA DPD byly odhaleny následující sestřihové varianty: delece exonů 2–8 a současně 3–8 a to u 40,7% vyšetřovaných, s menším zastoupení pak delece exonů 10, 13, 18, 20, 15–20 a 17–20. Jelikož získané mutační spektrum v genu DPD neposkytuje přímou odpověď na původ toxické reakce, byla zahájena analýza genu DPYS. Současné výsledky získané metodou DHPLC ukazují na přítomnost silent mutací c.15 G>A (S5S), c.216 C>T (F72F) a intronových alterací IVS 1–58 T>C, IVS 1+20 A>G zatím nejasného významu. Zajímavou se jeví záměna c.-1 T>C. Na výsledcích expresních microarrayí nejsou patrny signifikantní rozdíly v expresním profilu lymfocytů posuzovaných skupin pacientů. Významnější overexpresi u kontrolní populace vykazovaly geny BRCA1, CYP1A2, NR1I3, HMOX1 a DPD. Naopak geny RXRA a CYP2D6 byly exprimovány ve vyšší míře u pacientů s toxickými projevy léčby.
Současné výsledky ukazují, že sekvenční alterace DPD jsou nepravděpodobnou příčinnou vzniku 5-FU toxicity. Zajímavým zjištěním je častá přítomnost genomových změn DPYS, avšak pro jejich validaci je nezbytné provedení funkčních analýz. Data expresních arrayí ukazují, že na rozvoji toxicity se mohou podílet i další genové produkty.

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR 1A8708-4 a projektem Ligy proti rakovině Praha