Konference: 2005 XXIX. Brněnské onkologické dny a XIX. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Zhoubné nádory prsu
Téma: Karcinom prsu - pokroky v diagnostice a léčbě
Číslo abstraktu: 136
Autoři: MUDr. Filip Janků; MUDr. Josef Srovnal, Ph.D.; Mgr. Gabriela Kořínková, Ph.D.; Doc. MUDr. Jan Novotný, Ph.D.; prof. MUDr. Luboš Petruželka, CSc.; doc. MUDr. Marián Hajdúch, Ph.D.
Úvod
Hematogenní rozsev je příčinou vzniku vzdálených metastáz u časného karcinomu prsu. Nález izolovaných nádorových buněk v krvi nebo kostní dřeni znamená pro pacientku horší prognózu, nicméně současné stagingové klasifikace to zatím nezohledňují. V detekci okultních nádorových buněk byly odzkoušeny převážně metodiky imunocytochemické. Reverzní polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) nabízí o 2 až 3 řády vyšší senzitivitu nicméně její význam zůstává kontroverzní. Je to kvůli specificitě závislé na použitých primerech a počtu amplifikačních cyklů. Karcinoembryonální antigen (CEA) je onkofetální glykoprotein, který se často používá jako sérový nádorový marker především u nádorů střeva a prsu. Doposud bylo odzkoušeno několik technik RT PCR detekce pro CEA. Gerhard a spol. zveřejnil výsledky s RT PCR detekcí CEA u pacientů s kolorektálním karcinomem. Mitas a spol. použil kvantitativní CEA-RT-PCR za účelem detekce okultních nádorových buněk v axilárních lymfatických uzlinách pacientek s karcinomem prsu. V naší studii hodnotíme přítomnost okultních nádorových buněk v kostní dřeni pacientek s časným karcinomem prsu pomocí kvantitativní CEA-RT-PCR.
Metodika
Soubor pacientek
Do projektu byly od června 2001 do října 2004 zařazovány pacientky s primárním karcinomem prsu léčené na Onkologické klinice 1. LF UK a VFN v Praze. Pacientky musely být po radikálním chirurgickém výkonu bez známek onemocnění nebo indikovány k neoadjuvantní terapii s radikálním záměrem. Pacientky byly následně léčeny dle aktuálně platných konsensuálních doporučení ze St. Gallen. Celkem bylo zařazeno 70 pacientek: 26 (37 %) se stádiem I, 19 (27 %) se stádiem IIA, 23 (33 %) se stádiem IIB a 2 (3 %) se stádiem IIIB. Podrobná charakteristika souboru je popsána v tabulce 1. Adjuvantní chemoterapie s antracyklíny, bez antracyklínů nebo s antracyklíny a taxány byla podána 51 (73 %) pacientkám. Z 62 (89 %) pacientek s expresí hormonálních receptorů bylo adekvátní hormonální léčbou léčeno 54 (77%) žen. Zbylých 8 pacientek s pozitivitou hormonálních receptorů bude léčeno adjuvantní hormonální léčbou po dokončení adjuvantní chemoterapie. Devět premenopauzálních pacientek podstoupilo chirurgickou nebo farmakologickou ovariální blokádu. Všechny pacientky po konzervativním výkonu podstoupily nebo podstoupí ozáření prsu. U pacientek, kde byly zjištěny více než 3 infiltrované axilární uzliny bylo indikováno ozáření axily.
Výzkum byl schválen místní etickou komisí a probíhal ve shodě s Helsinskou deklarací. Všechny pacientky podepsaly informovaný souhlas.
Aspirace kostní dřeně
Aspiráty kostní dřeně byly odebrány technikou sternální punkce nebo punkcí v oblasti spina iliaca posterior et superior lopaty kosti kyčelní. Před vlastním odběrem byla provedena drobná incize kůže k zamezení kontaminace vzorku epitelovými buňkami. Celkem bylo odebráno mezi 0,5 a 7,5 ml (medián 1,5 ml) kostní dřeně. U 49 pacientek byla provedena sternální punkce a u 21 pacientek aspirace z lopaty kosti kyčelní. Obě techniky poskytly dostatek materiálu.
Zpracování vzorků kostní dřeně
RNA byla izolována pomocí komerčně dostupného kitu (QIAamp RNA Blood Kit, Qiagen, Valencia, USA) dle instrukcí výrobce. Čistota a integrita RNA byla ověřena na UV spektrofotometru.
Kvantitativní RT-PCR
Kvantitativní stanovení genové exprese karcinoembryonálního antigenu (CEA) bylo provedeno metodou real-time RT-PCR. Principem metody je snímání nárůstu fluorescenčního záření během vlastních PCR cyklů v reálném čase, což za použití standardizačních křivek umožní přesnou, reprodukovatelnou a absolutní kvantifikaci hledaného markeru ve vzorku. Jako detekční systém použijeme specifických TaqMan sond s flourochromem HEX a zhášečem BHQ1 (Generi-Biotech). Standardy pro kvantifikaci byly zkonstruovány zaklonováním specifické sekvence genu do plazmidu pZero. Po namnožení plazmidu a spektrofotometrickém změření jeho koncentrace se sestrojí diluční řada, která dá při vlastní PCR reakci vzniknout standardizační křivce. Real-time RT-PCR bylo provedeno na real-time cykléru Rotor-Gene 3000 (Corbett-Research). PCR reakce byla zahájena 15-ti minutovou inkubací při teplotě 96°C, kdy došlo k aktivaci HotStart Taq polymerázy (AB Gene). Poté následovalo samotné cyklování – 15s/95°C – l5s/65°C. Reakční směs o celkovém objemu 25ul pro detekci karcinoembryonálního antigenu obsahovala primery o koncentraci CEA3 300nM, CEA4 600nM, specifickou TaqMan sondu CEAP o koncentraci 200nM (vše Generi-Biotech), MgCl2 3mM, 10x PCR buffer, 1U HotStart Taq polymerázy (vše AB Gene), dNTP 200uM (Promega) a 100ng cDNA. Vyhodnocení real-time RT-PCR reakce bylo provedeno softwarem přístroje Rotor-Gene 3000 (Corbett-Research) a absolutní kvantifikace hledaného markeru bude vztažena na množství RNA vstupující do reverzní transkripce.
Výsledky
Transkripty CEA byly zjištěny ve vzorcích kostní dřeně 29 (41%) pacientek. Jednalo se od 10 (35%) pacientek stádia I, 9 (31%) pacientek stádia IIA, 9 (31%) pacientek stádia IIB a 1 (3%) pacientku stádia IIIB. Patnáct (52%) pacientek s transkripty CEA v kostní dřeni mělo infiltrované axilární lymfatické uzliny. Nebyly pozorovány statisticky významné korelace mezi expresí CEA v kostní dřeni a ostatními klinickými a patologickými rysy jakou jsou velikost nádoru, počet infiltrovaných axilárních lymfatických uzlin, histopatologický typ, nádorový grading, exprese hormonální receptorů, exprese HER2/neu. Medián doby sledování činil 22 měsíců (2 až 45). Doposud byla zjištěna recidiva u 9 (6%) pacientek, z nichž 2 měly prokázané okultní nádorové buňky v kostní dřeni pomocí CEA. V době analýzy jsme zaznamenali 2 (3%) úmrtí, která neměla vztah k nádoru (dopravní nehoda, plicní embolie). Výsledky jsou přehledně znázorněny v tabulce 2. V rámci hodnocení bezpříznakového období (disease free survival; DFS) byly metodicky jako události hodnoceny vzdálené a lokoregionální recidivy, nenádorová úmrtí, kontralaterální nádory a jiné primární nádory. Při hodnocení DFS (Kaplan-Meier) dochází k separaci křivek s tím, že exprese CEA v kostní dřeni se pojí s kratším DFS (viz obrázek). Nicméně výsledky se pohybují těsně nad hranicí statistické významnosti (p=0,05548, Gehan Wilcoxonův test).
Závěr
Okultní nádorové buňky jsme v aspirátech kostní dřeně pomocí RT-PCR detekce CEA prokázaly u 41% (29 ze 70) pacientek, což je srovnatelné s ostatními obdobnými studiemi. Na vyhodnocení prognostického významu detekce CEA je vzhledem ke krátké době sledování příliš brzy. Výsledky na hranici statistické významnosti zatím nelze přeceňovat jelikož jsou ovlivněny výskytem 2 nenádorových úmrtí v souboru (obě pacientky měly prokázaný CEA v kostní dřeni). Praktický dopad studie je dvojí. Za prvé, vyšetření je možné využít k molekulární detekci okultních nádorových buněk u pacientek s časnými stádii karcinomu prsu. Za druhé, metodiku lze dále zkoumat pro využití k hodnocení efektu adjuvantní léčby, který nemůžeme měřit pomocí biochemických nebo zobrazovacích metod. Hlavní nevýhodou RT-PCR je finanční a technická náročnost.
Poděkování
Podpořeno grantem Ligy proti rakovině a RASO ČOS.
Hematogenní rozsev je příčinou vzniku vzdálených metastáz u časného karcinomu prsu. Nález izolovaných nádorových buněk v krvi nebo kostní dřeni znamená pro pacientku horší prognózu, nicméně současné stagingové klasifikace to zatím nezohledňují. V detekci okultních nádorových buněk byly odzkoušeny převážně metodiky imunocytochemické. Reverzní polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) nabízí o 2 až 3 řády vyšší senzitivitu nicméně její význam zůstává kontroverzní. Je to kvůli specificitě závislé na použitých primerech a počtu amplifikačních cyklů. Karcinoembryonální antigen (CEA) je onkofetální glykoprotein, který se často používá jako sérový nádorový marker především u nádorů střeva a prsu. Doposud bylo odzkoušeno několik technik RT PCR detekce pro CEA. Gerhard a spol. zveřejnil výsledky s RT PCR detekcí CEA u pacientů s kolorektálním karcinomem. Mitas a spol. použil kvantitativní CEA-RT-PCR za účelem detekce okultních nádorových buněk v axilárních lymfatických uzlinách pacientek s karcinomem prsu. V naší studii hodnotíme přítomnost okultních nádorových buněk v kostní dřeni pacientek s časným karcinomem prsu pomocí kvantitativní CEA-RT-PCR.
Metodika
Soubor pacientek
Do projektu byly od června 2001 do října 2004 zařazovány pacientky s primárním karcinomem prsu léčené na Onkologické klinice 1. LF UK a VFN v Praze. Pacientky musely být po radikálním chirurgickém výkonu bez známek onemocnění nebo indikovány k neoadjuvantní terapii s radikálním záměrem. Pacientky byly následně léčeny dle aktuálně platných konsensuálních doporučení ze St. Gallen. Celkem bylo zařazeno 70 pacientek: 26 (37 %) se stádiem I, 19 (27 %) se stádiem IIA, 23 (33 %) se stádiem IIB a 2 (3 %) se stádiem IIIB. Podrobná charakteristika souboru je popsána v tabulce 1. Adjuvantní chemoterapie s antracyklíny, bez antracyklínů nebo s antracyklíny a taxány byla podána 51 (73 %) pacientkám. Z 62 (89 %) pacientek s expresí hormonálních receptorů bylo adekvátní hormonální léčbou léčeno 54 (77%) žen. Zbylých 8 pacientek s pozitivitou hormonálních receptorů bude léčeno adjuvantní hormonální léčbou po dokončení adjuvantní chemoterapie. Devět premenopauzálních pacientek podstoupilo chirurgickou nebo farmakologickou ovariální blokádu. Všechny pacientky po konzervativním výkonu podstoupily nebo podstoupí ozáření prsu. U pacientek, kde byly zjištěny více než 3 infiltrované axilární uzliny bylo indikováno ozáření axily.
Výzkum byl schválen místní etickou komisí a probíhal ve shodě s Helsinskou deklarací. Všechny pacientky podepsaly informovaný souhlas.
Aspirace kostní dřeně
Aspiráty kostní dřeně byly odebrány technikou sternální punkce nebo punkcí v oblasti spina iliaca posterior et superior lopaty kosti kyčelní. Před vlastním odběrem byla provedena drobná incize kůže k zamezení kontaminace vzorku epitelovými buňkami. Celkem bylo odebráno mezi 0,5 a 7,5 ml (medián 1,5 ml) kostní dřeně. U 49 pacientek byla provedena sternální punkce a u 21 pacientek aspirace z lopaty kosti kyčelní. Obě techniky poskytly dostatek materiálu.
Zpracování vzorků kostní dřeně
RNA byla izolována pomocí komerčně dostupného kitu (QIAamp RNA Blood Kit, Qiagen, Valencia, USA) dle instrukcí výrobce. Čistota a integrita RNA byla ověřena na UV spektrofotometru.
Kvantitativní RT-PCR
Kvantitativní stanovení genové exprese karcinoembryonálního antigenu (CEA) bylo provedeno metodou real-time RT-PCR. Principem metody je snímání nárůstu fluorescenčního záření během vlastních PCR cyklů v reálném čase, což za použití standardizačních křivek umožní přesnou, reprodukovatelnou a absolutní kvantifikaci hledaného markeru ve vzorku. Jako detekční systém použijeme specifických TaqMan sond s flourochromem HEX a zhášečem BHQ1 (Generi-Biotech). Standardy pro kvantifikaci byly zkonstruovány zaklonováním specifické sekvence genu do plazmidu pZero. Po namnožení plazmidu a spektrofotometrickém změření jeho koncentrace se sestrojí diluční řada, která dá při vlastní PCR reakci vzniknout standardizační křivce. Real-time RT-PCR bylo provedeno na real-time cykléru Rotor-Gene 3000 (Corbett-Research). PCR reakce byla zahájena 15-ti minutovou inkubací při teplotě 96°C, kdy došlo k aktivaci HotStart Taq polymerázy (AB Gene). Poté následovalo samotné cyklování – 15s/95°C – l5s/65°C. Reakční směs o celkovém objemu 25ul pro detekci karcinoembryonálního antigenu obsahovala primery o koncentraci CEA3 300nM, CEA4 600nM, specifickou TaqMan sondu CEAP o koncentraci 200nM (vše Generi-Biotech), MgCl2 3mM, 10x PCR buffer, 1U HotStart Taq polymerázy (vše AB Gene), dNTP 200uM (Promega) a 100ng cDNA. Vyhodnocení real-time RT-PCR reakce bylo provedeno softwarem přístroje Rotor-Gene 3000 (Corbett-Research) a absolutní kvantifikace hledaného markeru bude vztažena na množství RNA vstupující do reverzní transkripce.
Výsledky
Transkripty CEA byly zjištěny ve vzorcích kostní dřeně 29 (41%) pacientek. Jednalo se od 10 (35%) pacientek stádia I, 9 (31%) pacientek stádia IIA, 9 (31%) pacientek stádia IIB a 1 (3%) pacientku stádia IIIB. Patnáct (52%) pacientek s transkripty CEA v kostní dřeni mělo infiltrované axilární lymfatické uzliny. Nebyly pozorovány statisticky významné korelace mezi expresí CEA v kostní dřeni a ostatními klinickými a patologickými rysy jakou jsou velikost nádoru, počet infiltrovaných axilárních lymfatických uzlin, histopatologický typ, nádorový grading, exprese hormonální receptorů, exprese HER2/neu. Medián doby sledování činil 22 měsíců (2 až 45). Doposud byla zjištěna recidiva u 9 (6%) pacientek, z nichž 2 měly prokázané okultní nádorové buňky v kostní dřeni pomocí CEA. V době analýzy jsme zaznamenali 2 (3%) úmrtí, která neměla vztah k nádoru (dopravní nehoda, plicní embolie). Výsledky jsou přehledně znázorněny v tabulce 2. V rámci hodnocení bezpříznakového období (disease free survival; DFS) byly metodicky jako události hodnoceny vzdálené a lokoregionální recidivy, nenádorová úmrtí, kontralaterální nádory a jiné primární nádory. Při hodnocení DFS (Kaplan-Meier) dochází k separaci křivek s tím, že exprese CEA v kostní dřeni se pojí s kratším DFS (viz obrázek). Nicméně výsledky se pohybují těsně nad hranicí statistické významnosti (p=0,05548, Gehan Wilcoxonův test).
Závěr
Okultní nádorové buňky jsme v aspirátech kostní dřeně pomocí RT-PCR detekce CEA prokázaly u 41% (29 ze 70) pacientek, což je srovnatelné s ostatními obdobnými studiemi. Na vyhodnocení prognostického významu detekce CEA je vzhledem ke krátké době sledování příliš brzy. Výsledky na hranici statistické významnosti zatím nelze přeceňovat jelikož jsou ovlivněny výskytem 2 nenádorových úmrtí v souboru (obě pacientky měly prokázaný CEA v kostní dřeni). Praktický dopad studie je dvojí. Za prvé, vyšetření je možné využít k molekulární detekci okultních nádorových buněk u pacientek s časnými stádii karcinomu prsu. Za druhé, metodiku lze dále zkoumat pro využití k hodnocení efektu adjuvantní léčby, který nemůžeme měřit pomocí biochemických nebo zobrazovacích metod. Hlavní nevýhodou RT-PCR je finanční a technická náročnost.
Poděkování
Podpořeno grantem Ligy proti rakovině a RASO ČOS.
Datum přednesení příspěvku: 27. 5. 2005
