Konference: 2009 XXXIII. Brněnské onkologické dny a XXIII. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Onkologická diagnostika
Téma: II. Nádorová genetika
Číslo abstraktu: 035p
Autoři: RNDr. Eva Macháčková, Ph.D.; Mgr. Miroslava Lukešová; Mgr. Jana Házová; Hana Pavlů; Veronika Kosinová; Jitka Kuklová; MUDr. Marie Navrátilová, Ph.D.; Doc.MUDr. Lenka Foretová , Ph.D.
Asi 5-10% nádorových onemocnění může být
způsobeno dědičnou dispozicí. V rodinách s opakovaným výskytem
určitých nádorů, s velmi časným onemocněním je vhodné genetické
vyšetření. V laboratoři molekulární genetiky nádorů OEGN provádíme
vyšetření některých vysoce rizikových genů, které způsobují
hereditární nádorové predispozice - přehled je uveden v
Tabulce.
Genetické vyšetření v onkologii je prováděno pro odhalení dědičných forem nádorů, což umožní geneticky testovat i příbuzné a zjistit, jaká rizika onemocnění lze u nich předpokládat. V případě vysokého rizika jsou navrhována preventivní opatření, která by mohla snížit pravděpodobnost onemocnění a zachytit nádor v počátečním stádiu.
Genetické poradenství lze nabídnout rodinám, kde se vyskytují některé z těchto rizikových faktorů:
Indikace k testování je možné nalézt na www.mou.cz.
Od roku 2007 používáme v laboratoři jako screeningovou metodu vysokorozlišovací analýzu křivek tání (HRM - High Resolution Melting), založenou na principu heteroduplexní analýzy s vyhodnocováním na přístroji LightScanner firmy Idaho Technologies. Vlastní metoda využívá vlastností fluorescenční barvy (u nás používáme LCGreen plus), která se během PCR reakce inkorporuje do dsDNA. Během postupného zahřívání dochází k meltingu (denaturaci) DNA a barva se z jednořetězců uvolňuje, což se projevuje poklesem fluorescence. Přítomnost heteroduplexu v analyzovaném fragmentu DNA výrazně mění profil křivky meltingu. Metoda HRM umožňuje ve většině případů přesné rozlišení různých polymorfismů a mutací lokalizovaných ve stejném fragmentu a mnohdy zachytí také homozygotní varianty polymorfních oblastí - Obrázek 1. Rozlišení obou forem homozygotů v polymorfních oblastech je však možný pouze u některých oblastí - v závislosti na sekvenci analyzovaného úseku. Záchyt heterozygotního stavu je u metody HRM téměř 100%.
Metodu HRM používáme jako pre-sekvenační, tj. pozitivní nálezy mutací jsou vždy ověřeny sekvenováním, i když se profil mutace v HRM jeví jako naprosto jednoznačný. Fragmenty s abnormálním meltingem jsou sekvenovány na Genetic Analyser 3130 (Appplied Biosystems).
Metodou HRM je vyšetřována kompletní kódující sekvence a místa setřihu genů: BRCA1, BRCA2, MLH1, MSH2, MSH6, CDH-1. TJ genu CHEK2 jsou rutinně vyšetřovány pouze 2 mutace specifické pro CR: delece exonu 9-10 a IlOOdelC. U velmi vzácných syndromů probíhá vyšetření přímým sekvenováním jednotlivých exonů - geny TP53, CDKN2A (transkripční varianty pl6/INK4a a pl4/ARF).
K vyšetření velkých intragenových přeskupení používáme v laboratoři metodu MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), která zachytí delece/inzerce jednotlivých exonů až po deleci celé alely genu. Metodou MLPA jsou rutinně vyšetřovány geny BRCA1, MLH1, MSH2, MSH6.
Převedení klasické heteroduplexní analýzy na HRM analýzu a následně využití 4-kapilárního sekvenátoru ABI3130 vedlo k výraznému zvýšení senzitivity a specifity, vyšší automatizaci vyšetření a k celkovému urychlení vyšetření. Celková doba potřebná ke kompletnímu vyšetření genů BRCA1 a BRCA2 byla zkrácená na polovinu.
Pomocí HRM byly také zachyceny některé „nonsense" mutace a mutace v místech sestřihu, které nebyly klasickou heteroduplexní analýzou zachytitelné (všechny nově zachycené mutace jsou zpětně ověřovány původně používanou metodou). V současné době plánujeme provedení retrospektivní studie u vysoce rizikových probandů bez nálezu mutace, kteří byli v minulosti vyšetřeni klasickou heteroduplexní analýzou.
Genetické vyšetření v onkologii je prováděno pro odhalení dědičných forem nádorů, což umožní geneticky testovat i příbuzné a zjistit, jaká rizika onemocnění lze u nich předpokládat. V případě vysokého rizika jsou navrhována preventivní opatření, která by mohla snížit pravděpodobnost onemocnění a zachytit nádor v počátečním stádiu.
Genetické poradenství lze nabídnout rodinám, kde se vyskytují některé z těchto rizikových faktorů:
- opakovaný výskyt nádorů prsu a/nebo vaječníků v rodině (dva a více případů v linii)
- ženy s ojedinělým výskytem nádoru prsu nebo vaječníků před 35 rokem věku
- ženy s duplicitou nádoru prsu a vaječníků v jakémkoliv věku
- výskyt nádoru prsu u muže
- opakovaný výskyt nádorů tlustého střeva a dělohy v rodině (dva a více případů v linii)
- nádor kolorekta nebo nádor dělohy před 35 rokem věku
- duplicita nádoru kolorekta a dělohy u pacienta v kterémkoliv věku
- vícečetný výskyt maligních melanomu v linii, alespoň jednou pod 50 let
- opakovaný výskyt jiných typů nádorů, kombinace různých nádorových onemocnění, obzvláště pokud se vyskytly v mladém věku
Indikace k testování je možné nalézt na www.mou.cz.
Od roku 2007 používáme v laboratoři jako screeningovou metodu vysokorozlišovací analýzu křivek tání (HRM - High Resolution Melting), založenou na principu heteroduplexní analýzy s vyhodnocováním na přístroji LightScanner firmy Idaho Technologies. Vlastní metoda využívá vlastností fluorescenční barvy (u nás používáme LCGreen plus), která se během PCR reakce inkorporuje do dsDNA. Během postupného zahřívání dochází k meltingu (denaturaci) DNA a barva se z jednořetězců uvolňuje, což se projevuje poklesem fluorescence. Přítomnost heteroduplexu v analyzovaném fragmentu DNA výrazně mění profil křivky meltingu. Metoda HRM umožňuje ve většině případů přesné rozlišení různých polymorfismů a mutací lokalizovaných ve stejném fragmentu a mnohdy zachytí také homozygotní varianty polymorfních oblastí - Obrázek 1. Rozlišení obou forem homozygotů v polymorfních oblastech je však možný pouze u některých oblastí - v závislosti na sekvenci analyzovaného úseku. Záchyt heterozygotního stavu je u metody HRM téměř 100%.
Metodu HRM používáme jako pre-sekvenační, tj. pozitivní nálezy mutací jsou vždy ověřeny sekvenováním, i když se profil mutace v HRM jeví jako naprosto jednoznačný. Fragmenty s abnormálním meltingem jsou sekvenovány na Genetic Analyser 3130 (Appplied Biosystems).
Metodou HRM je vyšetřována kompletní kódující sekvence a místa setřihu genů: BRCA1, BRCA2, MLH1, MSH2, MSH6, CDH-1. TJ genu CHEK2 jsou rutinně vyšetřovány pouze 2 mutace specifické pro CR: delece exonu 9-10 a IlOOdelC. U velmi vzácných syndromů probíhá vyšetření přímým sekvenováním jednotlivých exonů - geny TP53, CDKN2A (transkripční varianty pl6/INK4a a pl4/ARF).
K vyšetření velkých intragenových přeskupení používáme v laboratoři metodu MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), která zachytí delece/inzerce jednotlivých exonů až po deleci celé alely genu. Metodou MLPA jsou rutinně vyšetřovány geny BRCA1, MLH1, MSH2, MSH6.
Převedení klasické heteroduplexní analýzy na HRM analýzu a následně využití 4-kapilárního sekvenátoru ABI3130 vedlo k výraznému zvýšení senzitivity a specifity, vyšší automatizaci vyšetření a k celkovému urychlení vyšetření. Celková doba potřebná ke kompletnímu vyšetření genů BRCA1 a BRCA2 byla zkrácená na polovinu.
Pomocí HRM byly také zachyceny některé „nonsense" mutace a mutace v místech sestřihu, které nebyly klasickou heteroduplexní analýzou zachytitelné (všechny nově zachycené mutace jsou zpětně ověřovány původně používanou metodou). V současné době plánujeme provedení retrospektivní studie u vysoce rizikových probandů bez nálezu mutace, kteří byli v minulosti vyšetřeni klasickou heteroduplexní analýzou.
Tato práce byla podpořena grantem Ministerstva
zdravotnictvíMZ0MOU2005.
Datum přednesení příspěvku: 16. 4. 2009
