Konference: 2013 XXXVII. Brněnské onkologické dny a XXVII. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: XXVII. Základní a aplikovaný výzkum v onkologii
Číslo abstraktu: 272
Autoři: MUDr. Jaromír Gumulec, Ph.D.; Markéta Sztalmachová; Ing. Hana Polanská; Mgr. Martina Raudenská, Ph.D.; RNDr. Jan Balvan; doc.Ing. René Kizek, Ph.D.; doc.RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D.; doc., RNDr. Michal Masařík, Ph.D.
Východiska:
Cisplatina je chemoterapeutikum užívané v léčbě řady onkologických onemocnění. Významným limitem jejího užití je relativně častý vývoj rezistencí. Cílem této studie je popsat změny vedoucí k rezistenci na modelu karcinomu prostaty za využití analýzy růstu buněk a flow-cytometrie.
Materiál a metody:
Byly použity následující buněčné linie: a) nenádorová PNT1A a nádorové b) 22Rv1 (primární tu), a c) metastatická PC-3 s nefunkčním p53. Buňky byly vystaveny koncentraci cisplatiny (0-150 µM), byl analyzován růst pomocí real-time analýzy buněk xCELLigence (RTCA) (Acea Biosciences Inc., USA) a po 48 hod byla analyzována toxicita pomocí MTT testu, flow-cytometrická analýza buněčného cyklu a western-blot p53. Proteiny byly separovány na 10% SDS-PAGE gelech (BioRad, USA) a imunodetekovány specifickou protilátkou proti p53. Ke statistickému zhodnocení byly použity obecné regresní modely a Tukeyův post-hoc test. Hladina p < 0,05 byla považována za signifikantní.
Výsledky:
Nejprve byly stanoveny 50% inhibiční koncentrace (IC50) pomocí MTT a RTCA. Byly zjištěny signifikantní rozdíly u p53-mutované linie PC3: metabolická MTT assay zjišťuje výrazně nižší IC50 oproti RTCA (IC50 = 10,6 a 25,6 µM dle MTT a RTCA), ostatní linie vykazovaly méně výrazné rozdíly. Analýza buněčného cyklu poukazovala na výrazný rozdíl mezi liniemi. Zatímco již minimální koncentrace cisplatiny způsobovaly zástavu buněčného cyklu (vzrůst % buněk v G0 fázi) u PNT1A a 22Rv1, p53-mutovaná PC-3 rozdíly mezi koncentracemi nevykazovala (max. 1,3 % buněk v G0 fázi ve všech koncentracích cisplatiny). Následně bylo ověřeno, zdali PC-3 neexprimují p53. Hladina p53 u PC-3 byla pod limitem detekce, hladina p53 u PNT1A byla signifikantně vyšší oproti nádorové 22Rv1 (p < 0,05; obr. 1). Buněčná linie PC-3 díky mutaci v p53 vykazuje falešně nízkou viabilitu po expozici cisplatině dle MTT, u buněk nenastává zástava buněčného cyklu. To spolu s vyšší IC-50 zjištěnou pomocí RTCA oproti MTT poukazuje na fakt, že cisplatina tlumí metabolickou aktivitu a vyvolá autofagii.
Závěr:
U p53-dekfektní linie PC-3 jsme prokázali cisplatinou indukovaný pokles metabolické aktivity s žádnými změnami v buněčném cyklu s pravděpodobnou autofagií. Tyto mechanizmy se podílejí na rozvoji p53-ovlivněné rezistenci vůči cisplatině, buněčná linie PC-3 se proto jeví jako zajímavý model pro další studium rezistence.
Obr. 1. A) MTT test u buněčných linií. B) flow-cytometrická analýza buněčného cyklu, C) western-blot p53; *signifikantní na p < 0,05.
Práce byla podpořena projektem Ceitec CZ.1.05/1.1.00/02.0068 a Ceitec doc 02/2012.
Datum přednesení příspěvku: 18. 4. 2013
