MIR-215 JAKO POTENCIÁLNÍ TERAPEUTICKÝ CÍL: PILOTNÍ STUDIE NAVÝŠENÍ EXPRESE V ANIMÁLNÍM MODELU KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU

Východiska:

 MikroRNA působí jako posttranskripční regulátory exprese většiny genů. Dysregulace jejich sítě byla prokázána u nádorových onemocnění včetně kolorektálního karcinomu (CRC). Již dříve jsme identifikovali miR-215 jako tumorový supresor specifický pro tkáň CRC. Prezentované in vivo experimenty ověřují její působení v kontextu celého organizmu. Posloužily také k zavedení a optimalizaci techniky subkutánní xenotransplantace na našem pracovišti.

Materiál a metody:

  Příprava buněk: Buňky linie HCT-116+/ + byly transfekovány CMV vektorem s klonovanou sekvencí pre-miR-215 nebo kontrolním mock-vektorem (OriGene Technologies, Rockville, USA). Stabilně transfekované buňky byly selektovány pomocí G-418 za fluorescenční kontroly exprese GFP. Po limitním naředění bylo provedeno namnožení 14 klonů buněk a jejich charakterizace (morfologie, rychlost proliferace, exprese miR-215 a vybraných genů). Subkutánní xenotransplantace: Animální experimenty byly provedeny v souladu se schváleným projektem pokusů. a) 1. pilotní pokus: Třem samicím NSG myši bylo na dorzální stranu těla vpravo s.c. aplikováno 5 × 106 buněk klonu 33 miR- 215-HCT-116+/ +. Jako kontrola byl aplikován vlevo stejný počet buněk mock-HCT-116+/ +. 27. den po aplikaci byl pokus ukončen, nádory byly změřeny a byl proveden odběr vzorku nádorové tkáně. b) 2. pilotní pokus: Pěti samcům NSG myši bylo s.c. aplikováno 2,5 × 106 buněk klonu 33 miR-215-HCT-116+/ +. Jako kontrola byl aplikován vlevo stejný počet buněk mock-HCT-116+/ +. 24. den po aplikaci byl pokus ukončen.

Výsledky:

  V pilotním experimentu byly úspěšně připraveny buňky linie odvozené od CRC se stabilně navýšenou expresí miR-215. Selekcí klonů s následnou charakterizací byl vybrán a namnožen klon s optimálními vlastnostmi. Klon byl subkutánně aplikován NSG myším. Po 10–12 dnech byly v podkoží hmatné tumory, experimenty byly ukončeny 27., resp. 24. den po aplikaci. Odebraná nádorová tkáň byla histologicky zhodnocena jako nízce diferencované nádorové buňky s vysokou mitotickou aktivitou. Kontrolní tumory vykazovaly vyšší míru nekróz než tumory vzniklé z buněk s navýšením miR-215. Tumory vzniklé z buněk s navýšením miR-215 měly signifikantně menší objem než kontrolní tumory (p < 0,05).

Závěr:

 Experimenty in vivo doplnily souhrn poznatků o tumorově supresorovém působení miR-215. Na jejich základě budou provedeny další experimenty s terapeutickou aplikací miR-215 pomocí specifického nosiče. MiR-215 je nadějnou cestou ve vývoji nových léčiv cílené terapie CRC.

Práce byla podpořena projektem MUNI/ A/ 0886/ 2013.