Mikrogenomika ve studiu nádorové biologie

V poslední době se v experimentální praxi stále ve větší míře uplatňují metody využívající mikročipové expresní analýzy. Většina expresních analýz solidních nádorů vychází z bioptických vzorků, které obsahují velké množství kontaminujících stromálních a dalších typů buněk. Tyto buňky však ovlivňují celkovou informaci o genové expresi a znesnadňují tak rozlišení specifické genové exprese nádorových buněk. Mezi metody, které umožňují selekci přesně definovaných populací buněk patří laserová a mechanická mikrodisekce. Současné čipy vyžadují mikrogramová množství značené nukleové kyseliny, přičemž vstupní množství RNA ze selektovaných buněk se může pohybovat pouze v nanogramovém až pikogramovém řádu. Tento problém je možno řešit různými způsoby amplifikace RNA, mezi které patří dvojitá lineární amplifikace RNA, metody využívající kombinovanou PCR s linearní amplifikací a další (Xiang et al. 2003, Aoyagi et al. 2003, Klur et al. 2004, Thelen et al. 2004). Některé amplifikační metody umožňují expresní analýzu RNA izolované z jediné buňky. Určitým problémem těchto expresních analýz je ovlivnění zastoupení jednotlivých mRNA během amplifikace (Jenson et al. 2003, Klur et al. 2004). Kvalitu výsledků ovlivňuje také způsob fixace tkání, případná archivace tkáňového vzorku v parafínovém bloku a imunohistochemické barvení (Fend et al. 1999, Kabbarah et al. 2003, Qin et al. 2003).V naší laboratoři používáme mechanickou mikrodisekci Eppendorf z kryořezů prsních tkání, kombinovanou PCR s lineární amplifikací RNA firmy Roche a oligonukleotidové čipy firmy Affymetrix. Vedle nekomerčních postupů jsou další systémy pro amplifikaci RNA dodávány například firmami Ambion, Arcturus a Artus-Biotech (viz seznam webových stránek). Používání mikrogenomických metod může vedle základního výzkumu pomoci při vývoji nových diagnostických postupů, které podle expresní analýzy několika buněk z minimální biopsie mohou v budoucnu přispět k cílené terapii nádorů.

Práce byla podpořena granty NR 7844-3 a MSM 6198959216.

Literatura

1. Xiang CC, Chen M, Ma L, Phan QN, Inman JM, Kozhich OA, Brownstein MJ. A new strategy to amplify degraded RNA from small tissue samples for microarray studies. Nucleic Acids Res 2003; 31: e53.
   
2. Aoyagi K, Tatsuta T, Nishigaki M, Akimoto S, Tanabe C, Omoto Y, Hayashi S, Sakamoto H, Sakamoto M, Yoshida T, Terada M, Sasaki H. A faithful method for PCR-mediated global mRNA amplification and its integration into microarray analysis on laser-captured cells. Biochem Biophys Res Commun 2003; 300: 915-20.
   
3. Klur S, Toy K, Williams MP, Certa U. Evaluation of procedures for amplification of small-size samples for hybridization on microarrays. Genomics 2004; 83: 508-17.
   
4. Thelen P, Burfeind P, Grzmil M, Voigt S, Ringert RH, Hemmerlein B. cDNA microarray analysis with amplified RNA after isolation of intact cellular RNA from neoplastic and non-neoplastic prostate tissue separated by laser microdissections. Int J Oncol 2004; 24: 1085-92.
   
5. Jenson SD, Robetorye RS, Bohling SD, Schumacher JA, Morgan JW, Lim MS, Elenitoba-Johnson KS. Validation of cDNA microarray gene expression data obtained from linearly amplified RNA. Mol Pathol 2003; 56: 307-12.
   
6. Fend F, Emmert-Buck MR, Chuaqui R, Cole K, Lee J, Liotta LA, Raffeld M. Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis. Am J Pathol 1999; 154: 61-6.
   
7. Kabbarah O, Pinto K, Mutch DG, Goodfellow PJ. Expression profiling of mouse endometrial cancers microdissected from ethanol-fixed, paraffin-embedded tissues. Am J Pathol 2003; 162: 755-62.
   
8. Qin Y, Heine VM, Karst H, Lucassen PJ, Joels M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Methods 2003; 131: 205-11.
   Webové stránky
   www.ambion.com, www.arctur.com, www.artus-biotech2.com, www.epicentre.com, www.roche-applied-science.com