METODY PROTEOMICKÉ ANALÝZY V ONKOLOGII SE ZAMĚŘENÍM NA PROTEINY OBSAHUJÍCÍ ZINEK

Východiska:  

Divalentní zinek, Zn(II) je esenciální pro buněčnou proliferaci, diferenciaci a regulaci apoptózy. Méně než 0,01 % Zn(II) se vyskytuje ve volné formě, volný Zn(II) hraje důležitou roli v regulaci buněčných procesů, především transkripce, imunomodulace a buněčné signalizace. Je známo, že buňky adenokarcinomu prostaty vykazují odlišnosti v metabolizmu a homeostáze Zn(II). Dysregulace Zn(II) byla nalezena i u dalších malignit, především ezofageální karcinom, ZN hlavy a krky a ZN prsu. V této práci byl navržen proces automatizované magnetické imunoextrakce Zn(II) vázajících proteinů (Zn-proteiny) z prostatických nádorových linií kultivovaných v přítomnosti ZnCl2.

Materiál a metody:

Linie LNCaP, PC-3 a PNT1-A byly kultivovány v přítomnosti 0, 25 a 50 uM ZnCl2 po dobu 72 hod, netoxický efekt ZnCl2 byl ověřen sledováním růstu a viability buněk (xCelligence, MTT test). Zn-proteiny byly izolovány z buněčného lyzátu pomocí paramagnetických částic s imobilizovanými anti Zn(II)-KLH protilátkami za použití robotické pipetovací stanice epMotion 5075. Izolované pro­teiny byly detekovány pomocí SDS-PAGE a koncentrace Zn(II) v jednotlivých frakcích byla stanovena pomocí diferenční pulzní voltametrie.

Výsledky:

Obsah Zn(II) v PC-3 lyzátech byl 2.9 uM v 106 buněk, což je 23 % ve srovnání s liniemi LNCaP a PNT1A. Se zvyšováním koncentrace ZnCl2 v médiu se zvyšoval i obsah Zn(ll) v lyzátech všech linií. Po opětovném stanovení Zn(II) v lyzátech po imunoextrakci (retentát) bylo zjištěno, že ve všech vzorcích došlo k úbytku Zn(II). Ve frakci eluované z paramagnetických částic byl obsah Zn(II) nejnižší u linie PC-3 a nejvyšší u kont­rolní linie PNT1A s výjimkou 50 uM ZnCl₂. Součet ob­sahu Zn(II) v retentátu a eluátu byl v průměru 90 % hodnotu obsahu Zn(II) v lyzátu. Dle SDS-PAGE byl patrný úbytek proteinů po imunoextrakci ve všech vzorcích. Nejvíce Zn-proteinů bylo izolováno u linie PNT1A a nejméně u linie PC-3. U elektroforetických profilů byly pozorovány výrazné odlišnosti jak mezi liniemi, tak v závislosti na koncentraci Zn(II).

Závěr:

Byla vyvinuta automatizovaná metoda magnetické imunoseparace Zn-proteinů. Tato metoda je pou­žitelná pro separaci a prefrakcionaci Zn-proteinů z biologického vzorku s dostatečným výtěžkem pro proteomickou analýzu.

Práce byla podpořena grantovými projekty Liga proti rakovině Praha, CYTORES GACR P301/10/0356 a Na-noBioTECell GACR P102/11/1068.