METODICKÉ ASPEKTY ANALÝZY EXTRACELULÁRNÍCH MIKRORNA V MOČI PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY UROLOGICKÝCH NÁDORŮ

Východiska:

Nádory močového měchýře, ledvin a prostaty jako nejvýznamnější urologické malignity představují v ČR přibližně 13 % nově diagnostikova­ných zhoubných nádorů a podílejí se z 3 % na celkové populační úmrtnosti. Zatímco v případě karcinomu prostaty je k dispozici účinný sérový biomarker PSA, u renálního či uroteliálního karcinomu žádný podobný biomarker není dostupný. Cystoskopie s cytologií moči, vylučovací urografie a ultrasonografie jsou v současné době nejpoužívanějšími metodami pro diagnostiku a monitorování těchto onemocnění. Jedná se o metody diskomfortní a invazivní. Neu­stále jsou proto hledány nové neinvazivní diagnostické postupy, které by ty stávající nahradily, a to především za účelem sledování a časného záchytu relapsu těchto onemocnění. V současnosti je velmi moderním přístupem při studiu a klasifikaci solidních nádorů na molekulární úrovni analýza mikroRNA (miRNA). Změny expresních profilů miRNA v nádorové tkáni, stejně jako v tělních tekutinách, jsou dnes intenzivně studovány u celé řady nádorových onemocnění včetně urologických nádorů. Výtěžky RNA z moči jsou velice nízké a její čistota není dle konvenčních kritérií dostatečná. Tato kritéria jsou ovšem v současné době přehodnocována, a to nejen pro RNA izolovanou z moči, ale také z krevního séra či plazmy.

Soubor pacientů a metody:

10 ml ranní/odpolední moči zdravých dárců bylo odebíráno do zkumavek obsahujících 0,186 g EDTA. Před izolací byly vzorky centrifugovány po dobu 15 min při 2 000 rpm/13 000 rpm a následně rozděleny k analýze intracelulární miRNA (pelet) a extracelulární miRNA (supernatant). Celková RNA byla izolována z 1 ml moči pomocí Urine microRNA Purification Kit (Norgen), eluce RNA probíhala do 40 ul. Koncentrace a čistota RNA byla měřena přístrojem NanoDrop-2000. Pomocí Taq microRNA Assays (Applied Biosystems) jsme stanovili expresi miR-125b, -21 a RNU6B.

Výsledky:

Pomocí qPCR jsme stanovili hladinu miR-125b, -21 v peletu i supernatantu moči, RNU6B byla detekována pouze v peletu, ne v supernatantu a nelze ji použít jako vhodnou endogenní kontrolu. Rozdílná exprese miRNA byla po­zorována v závislosti na míře centrifugace vzorku moči. Vyšší exprese miRNA byla naměřena u vzorků ranní moči.

Závěr: Předpokládáme, že miRNA nachá­zející se v moči mají potenciál sloužit jako nová třída neinvazivních diagnostických biomarkerů.

Práce byla podpořena Institucionálními zdroji pro Podporu výzkumných organizací poskytnutou Ministerstvem zdravotnictví České republiky v roce 2012.