Konference: 2004 XXVIII. Brněnské onkologické dny a XVIII. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Onkologická diagnostika
Téma: Molekulární a laboratorní diagnostika nádorů
Číslo abstraktu: 23
Autoři: MUDr. Rudolf Nenutil, CSc.; Mgr. Šárka Pavlová, PhD; prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.; Zina Hanzelková; RNDr. Bořivoj Vojtěšek, DrSc.
Úvod
Fosfoprotein p53 a jeho dráhy jsou uzlovým bodem řady buněčných procesů, zejména udržování stability genomu, regulace buněčného cyklu a apoptózy a významně se podílí na inhibici nádorového růstu. Gen TP53 je mutován, případně protein vykazuje alterovanou expresi u více než 50% zhoubných nádorů. Tato aberace je evidentně růstovou výhodou a vzhledem knarušení výše uvedených funkcí by teoreticky měla mít význam i pro odpověď nádoru na terapii poškozující DNA. Přesto není dosud stanovení p53 jednoznačným prognostickým ani prediktivním parametrem, není rutinně diagnosticky využíváno a nefiguruje v žádném standardním klinickém protokolu. Základním důvodem je skutečnost, že dosud nevíme, nakolik je alterace odpovědi na genotoxický stres zprostředkovaná p53 při terapii pro nádor výhodná nebo nevýhodná. Pokud je dráha p53 funkční, může totiž sice její aktivace způsobit lepší odpověď na terapii, ale naopak paradoxně nádorové buňky před léčbou i chránit, zejména je-li zachována odpověď ve smyslu zástavy buněčného cyklu a poškozena odpověď ve smyslu apoptózy. K takovému vyhodnocení dosud chybí zejména data, jak o stavu genu, tak i proteinu, případně funkčnosti dráhy p53, ve vztahu k aplikované terapii a odpovědi nádoru. Jedním z důvodů je obtížnost, pracnost, cena a částečně i nejednoznačnost používaných metodik (sekvenování, FASAY, imunohistologie). Z tohoto důvodu se pokoušíme vyvinout standardizovanou imunohistologickou metodiku kombinující senzitivní detekci p53, jeho fosforylovaných forem a jím indukovaných proteinů, která by poskytla detailnější informace.
Materiál a metody
Sestava zahrnula 35 karcinomů různých lokalizací (mamma, endometrium, cervix, ovarium) a byla na ní povedena imunohistologie p53 protilátkami DO-1 (celkový p53), FP3.1 (p53 fosforylovaný na Ser392 – tato modifikace je důležitá pro vazbu na DNA) a SER15 (p53 fosforylovaný na Ser15 – tato modifikace je klíčová pro odpověď dráhy p53). Dále byly vyšetřeny proteiny regulované drahou p53 a to MDM2 protilátkou 2A9 a p21/waf1 protilátkou 1.1.8. U všech nádorů byla stanovena proliferační aktivita (Ki67) a z paralelně odebraného zmrazeného nativního materiálu izolována cDNA a proveden funkční esej p53 na kvasinkách (FASSAY).
Výsledky
Dle funkčního testu bylo 16 z 35 vzorků s mutací p53. U mutovaných případů vykazovalo 11 ze 16 velmi vysokou hladinu celkového p53 (DO-1) a většinou (8 z 11 u Ser392 a 11 z 11 u Ser15) je tento protein i fosforylován. Ve dvou případech s mutací nebyl naopak protein p53 prokazatelný žádnou z použitých protilátek. Proteiny MDM2 a p21/waf1 byly u části nádorů s mutací zcela nedetekovatelné (u obou 5 ze 16). U všech 19 nádorů bez mutace p53 byl naopak celkový p53 detekovatelný i když na nízkých hladinách. Jeho detekovatelná fosforylace na Ser15 se vyskytovala jen poměrně vzácně (6 z 19), detekovatelná fosforylace na Ser392 byla o něco častější (13 z 19, úměrná celkové hladině proteinu). Hladiny MDM2 a p21/waf1 byly u nádorů bez mutace naopak vždy detekovatelné a korelovaly s celkovou hladinou p53.
Závěr
Většinu nádorů lze podle výsledků imunohistologického stanovení celkového p53, jeho fosforylovaných forem, MDM2, p21/waf1 a Ki67 přiřadit do určitých imunohistologických „vzorů exprese“ které korelují se stavem genu TP53 zjištěným metodou FASAY. Lze takto i vytvořit návrh klasifikačního algoritmu respektive odhadnout nakolik je funkce p53 i bez ohledu na případnou nepřítomnost mutace v nádoru zachována. Tento přístup by, vzhledem k aplikovatelnosti v rutinním bioptickém materiálu, mohl otevřít cestu ke klinicky relevantnímu stanovení funkce p53 v konkrétních případech a na retrospektivních sestavách.
Práce byla podporována Grantem IGA MZ ČR NC 7131-3
Fosfoprotein p53 a jeho dráhy jsou uzlovým bodem řady buněčných procesů, zejména udržování stability genomu, regulace buněčného cyklu a apoptózy a významně se podílí na inhibici nádorového růstu. Gen TP53 je mutován, případně protein vykazuje alterovanou expresi u více než 50% zhoubných nádorů. Tato aberace je evidentně růstovou výhodou a vzhledem knarušení výše uvedených funkcí by teoreticky měla mít význam i pro odpověď nádoru na terapii poškozující DNA. Přesto není dosud stanovení p53 jednoznačným prognostickým ani prediktivním parametrem, není rutinně diagnosticky využíváno a nefiguruje v žádném standardním klinickém protokolu. Základním důvodem je skutečnost, že dosud nevíme, nakolik je alterace odpovědi na genotoxický stres zprostředkovaná p53 při terapii pro nádor výhodná nebo nevýhodná. Pokud je dráha p53 funkční, může totiž sice její aktivace způsobit lepší odpověď na terapii, ale naopak paradoxně nádorové buňky před léčbou i chránit, zejména je-li zachována odpověď ve smyslu zástavy buněčného cyklu a poškozena odpověď ve smyslu apoptózy. K takovému vyhodnocení dosud chybí zejména data, jak o stavu genu, tak i proteinu, případně funkčnosti dráhy p53, ve vztahu k aplikované terapii a odpovědi nádoru. Jedním z důvodů je obtížnost, pracnost, cena a částečně i nejednoznačnost používaných metodik (sekvenování, FASAY, imunohistologie). Z tohoto důvodu se pokoušíme vyvinout standardizovanou imunohistologickou metodiku kombinující senzitivní detekci p53, jeho fosforylovaných forem a jím indukovaných proteinů, která by poskytla detailnější informace.
Materiál a metody
Sestava zahrnula 35 karcinomů různých lokalizací (mamma, endometrium, cervix, ovarium) a byla na ní povedena imunohistologie p53 protilátkami DO-1 (celkový p53), FP3.1 (p53 fosforylovaný na Ser392 – tato modifikace je důležitá pro vazbu na DNA) a SER15 (p53 fosforylovaný na Ser15 – tato modifikace je klíčová pro odpověď dráhy p53). Dále byly vyšetřeny proteiny regulované drahou p53 a to MDM2 protilátkou 2A9 a p21/waf1 protilátkou 1.1.8. U všech nádorů byla stanovena proliferační aktivita (Ki67) a z paralelně odebraného zmrazeného nativního materiálu izolována cDNA a proveden funkční esej p53 na kvasinkách (FASSAY).
Výsledky
Dle funkčního testu bylo 16 z 35 vzorků s mutací p53. U mutovaných případů vykazovalo 11 ze 16 velmi vysokou hladinu celkového p53 (DO-1) a většinou (8 z 11 u Ser392 a 11 z 11 u Ser15) je tento protein i fosforylován. Ve dvou případech s mutací nebyl naopak protein p53 prokazatelný žádnou z použitých protilátek. Proteiny MDM2 a p21/waf1 byly u části nádorů s mutací zcela nedetekovatelné (u obou 5 ze 16). U všech 19 nádorů bez mutace p53 byl naopak celkový p53 detekovatelný i když na nízkých hladinách. Jeho detekovatelná fosforylace na Ser15 se vyskytovala jen poměrně vzácně (6 z 19), detekovatelná fosforylace na Ser392 byla o něco častější (13 z 19, úměrná celkové hladině proteinu). Hladiny MDM2 a p21/waf1 byly u nádorů bez mutace naopak vždy detekovatelné a korelovaly s celkovou hladinou p53.
Závěr
Většinu nádorů lze podle výsledků imunohistologického stanovení celkového p53, jeho fosforylovaných forem, MDM2, p21/waf1 a Ki67 přiřadit do určitých imunohistologických „vzorů exprese“ které korelují se stavem genu TP53 zjištěným metodou FASAY. Lze takto i vytvořit návrh klasifikačního algoritmu respektive odhadnout nakolik je funkce p53 i bez ohledu na případnou nepřítomnost mutace v nádoru zachována. Tento přístup by, vzhledem k aplikovatelnosti v rutinním bioptickém materiálu, mohl otevřít cestu ke klinicky relevantnímu stanovení funkce p53 v konkrétních případech a na retrospektivních sestavách.
Práce byla podporována Grantem IGA MZ ČR NC 7131-3
Datum přednesení příspěvku: 26. 5. 2005
