Komplexy mědi s lawsonem jako nová protinádorová léčiva.

Klíčová slova: lawson, měď, cytotoxicita, oxidace, redukce, komplexy

Úvod

Skupina sekundárních metabolitů naftochinonů představuje nejčastěji jednoduché deriváty 1,4-naftochinonu (juglon, lawson, plumbagin), nicméně jsou známy také naftochinony složitě substituované, stejně jako formy dimerní a trimerní. Naftochinony byly nalezeny u zástupců řady rostlinných čeledí, stejně jako u mikroorganismů a hub (Babula, et al., Babula, et al.). Některé naftochinony plní nezastupitelnou úlohu fyziologickou a biochemickou – jedná se o vitamíny skupiny K, strukturální analoga 1,4naftochinonu substituované izoprenovým řetězcem různé délky (Damon, et al.). U organismů produkujících tyto látky mají funkci protektivní, a to zejména díky svým antimikrobiálním a antifungálním vlastnostem. Mezi další, neméně významný účinek řady naftochinonů patří také účinek cytotoxický. Tento účinek je založen na několika souběžných mechanizmech, mezi které patří generování reaktivních forem kyslíku s následnou aktivací proapoptických faktorů a down-regulací antiapoptických genů vedoucích k apoptóze, stejně jako interakce s biosyntézou nukleových kyselin, inhibice topoizomeráz i interakce s vlastní DNA, zejména interkalace (Babula, et al., Kiran Aithal, et al.).

Vlastní lawson, majoritní naftochinon Lawsonia inermis L. vykazuje výrazně cytotoxické účinky, které jsou, mimo jiné, podmíněny také jeho schopností generovat volné kyslíkové radikály (Sauriasari, et al.). Toxikologickým aspektem intoxikace lawsonem je lawsonem indukovaná hemolytická anémie, jejíž mechanismus je dán metabolizací lawsonu s následnou indukcí reaktivních forem kyslíku (McMillan, et al.).

Zajímavou možnost modifikace biologických účinků naftochinonů představuje příprava jejich derivátů a komplexů, jak již bylo prokázáno v případě dalších sekundárních metabolitů, ale také vlastních naftochinonů, včetně lawsonu. Zajímavou možnost obměny a vystupňování biologických účinků představuje příprava komplexů sekundárních metabolitů s ionty těžkých kovů. Jako zajímavé se jeví komplexy kvercetinu s měďnatými ionty, které vykazují schopnost přímé interakce s DNA a potažmo tedy výrazné cytotoxické vlastnosti (Tan, et al.). Literatura popisuje přípravu komplexů lawsonu a thoria(IV), mědi(II), zinku(II) a některých dalších, když o jejich biologických vlastnostech je toho známo zajím jen málo. (Hashem, et al., Al-Nady, et al., Neves, et al.).

Díky schopnosti naftochinonů generovat volné kyslíkové radikály – reaktivní formy kyslíku – s následnou indukcí apoptózy byly připraveny zcela nové komplexy naftochinonu lawsonu (2-hydroxy-1,4-naftochinon) s mědí(II) a dalším nenaftochononovým ligandem, které byly dále charakterizovány z pohledu oxidačně-redukčních vlastností. Cílem předložené práce je tedy studium oxidačně-redukčních vlastností komplexů lawsonu a měďnatých iontů s dalšími modifikujícími ligandy za použití analytické techniky cyklické voltametrie.

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Materiál a metody

Chemikálie

Pro syntézu komplexů byl použit lawson (Law, 2-hydroxy-1,4-naftochinon), octan měďnatý, resp. jeho monohydrate ((CH₃COO)₂Cu.H₂O), a další chemikálie p. a. čistoty (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Přehled použitých komplexů udává tab.1. Složení, čistota a stabilita použitých komplexů byla ověřena elementární analýzou a metodami spektrálními. Příprava těchto komplexů bude popsána v jiné publikaci.

Vlastní elektrochemické sledování DNA intarakcí – cyklická voltametrie

Z bezprostředně před měřením připravených zásobních roztoků komplexů lawsonu (1 mg.ml^–1 v DMSO bylo odpipetováno 100 µl do měrné nádobky s 1 ml acetátového pufru, pH 5. Samotné měření probíhalo na systému skládajícím se z potenciostatu µAUTOLAB TYPE III (EcoChemie, Nizozemí) a měřící části 663 VA STAND (Metrohm, Švýcarsko). 663 VA STAND byl opatřen klasickým tříelektrodovým zapojením, kde jako pracovní elektroda byla použita visící rtuťové kapková elektroda (HMDE), referenční elektroda byla Ag/AgCl/3M KCl a platinová elektroda sloužila jako srovnávací. Jako měřící metoda byla použita metoda cyklické voltametrie s následujícími parametry: probublávání argonem – 120 s; startovací potenciál 0.2 V; zlomový (vertex) potenciál -1.3 V; konečný potenciál 0.2 V; potenciálový krok – 0.00198 V; rychlost skenu – 0.2 V.s^–1.

Výsledky a diskuse

Oxidačně-redukční vlastnosti komplexů lawsonu



Tabulka 1.
Komplexy použité pro testování interakcí s DNA pomocí cyklické volta-
metrie. L – law son, py – pyridin, Im – Imidazol, apy – antipyrin,
pz – pyrazol, MeOH – mathanol, DMSO – dymethyl sulfoxid



U všech testovaných komplexů byla v průběhu forvard scanu, stejně jako reverse scanu, patrná řada píků, které odpovídají oxidaci/redukci daného komplexu a jejichž počet i pozice se lišily v závislosti na struktuře komplexu. Největší počet píků vykazoval komplex Law3 (10, nejméně pak pro chemicky nejjednodušší komplex Law1, který představuje hydratovaný komplex lawsonu a měďnatých iontů bez přítomnosti dalšího ligandu. Porovnání voltamogramů jednotlivých komplexů za daných experimentálních podmínek je ukázáno na obr.1 Shrnutí charakterizace jednotlivých komplexů a jednotlivých píků (pozice, výška píku) uvádí tab. 2.



Tabulka 2. Pozice a výšky píků, které byly identifikovány u jednotlivýcj komplexů law sonu

Pro vlastní schopnost generovat reaktivní formy kyslíku jsou důležité redukční vlastnosti komplexů, které jsou shrnuty v tabulce č. 3 jako počet redukčních píků a jejich součet. Podle součtu výšek jednotlivých redukčních píků je patrné, že nejvyšší redukční potenciál má vzorek s označením Law1. Při porovnání redukčních vlastností jednotlivých komplexů dostáváme následující řadu: Law1 > Law2 >> Law6 > Law5 > Law4 > Law7 > Law3.

Schopnost generovat reaktivní formy kyslíku patří mezi významné atributy cytotoxicity látek. Volné radikály poté poškozují nezbytné buněčné struktury, jako jsou membránové struktury (lipidová peroxidace), DNA a proteiny. Po testované komplexy je možné navrhnout následující mechanismus:



Hydroxylový radikál pak vystupuje jako vlastní reaktivní forma kyslíku poškozující důležité biomolekuly a buněčné struktury. Klíčovou roli ve výše uvedené reakci hraje peroxid vodíku, další reaktivní forma kyslíku, která je enzymaticky inaktivována (kataláza). V případě nádorových buněk, na kterých nepochybně uvedené komplexy budou dále testovány, lze předpokládat synergické cytotoxické účinky – na straně jedné účinek vlastního komplexu a jeho reakce s biomolekulami, na straně druhé vlastní metabolizace komplexu a jeho oxidačně-redukční vlastnosti, které mohou vést ke generování reaktivních forem kyslíku s následnou buněčnou smrtí. Pozorovaným, měřitelným efektem, je pak cytotoxicita a případné potenciální využití v terapii nádorových onemocnění.



Tabulka 3. Množství redikčních píků pro jednotlivé komplexy law sonu a součet výšek všech redukčních píků jednotlivých komplexů.

Závěr

V předložené práci jsou ukázány a diskutovány oxidačně-redukční vlastnosti zcela nově připravených komplexy mědi, naftochinonu lawsonu a dalšího ligandu, a to pomocí elektrochemické metody cyklické voltametrie. Oxidačně-redukční vlastnosti měďnatých komplexů mohou hrát významnou roli v cytotoxicitě zkoumaných komplexů, neboť k ní mohou významnou měrou přispívat, a to generováním volných kyslíkových radikálů, zejména hydroxylových. Významné zůstávají i další schopnosti naftochinonů, zejména interakce s DNA a interakce s mitochondriálním dýchacím řetězcem. Cytotoxické vlastnosti některých výše testovaných komplexů byly ověřeny předběžným testováním na rostlinných buněčných modelech, kde byl potvrzen synergismus účinku komplexu v porovnání s lawsonem, měďnatými ionty a příslušným ligandem. Na podrobnější testování na živočišných buněčných liniích včetně nádorových se zaměřením na mechanismus účinku však komplexy teprve čekají.

Literatura:

1. Babula, P., et al., (2006): Naftochinony – biosyntéza, výskyt a metabolismus v rostlinách, Česká a Slovenská Farmacie, 60: 151-159.
2. Babula, P., et al., (2009): Noteworthy Secondary Metabolites Naphthoquinones – their Occurrence, Pharmacological Properties and Analysis, Current Pharmaceutical Analysis, 5: 47-68.
3. Damon, M., et al., (2005): Phylloquinone (vitamin K1) content of vegetables, Journal of Food Composition and Analysis, 18: 751-758.
4. Babula, P., et al., (2007): Naftochinony a jejich farmakologické vlastnosti, Česká a Slovenská farmacie, 56: 114-120.
5. Kiran Aithal, B., et al., (2009): Juglone, a naphthoquinone from walnut, exerts cytotoxic and genotoxic effects against cultured melanoma tumor cells., Cell Biology International, 33: 1039-1049.
6. Sauriasari, R., et al., (2007): Cytotoxicity of lawsone and cytoprotective activity of antioxidants in catalase mutant Escherichia coli, Toxicology, 235: 103-111.
7. McMillan, D. C., et al., (2004): Role of oxidant stress in lawsone-induced hemolytic anemia, Toxicological Sciences, 82: 647-655.
8. Tan, J., et al., (2009): DNA binding and oxidative DNA damage induced by a quercetin copper(II) complex: potential mechanism of its antitumor properties., J Biol Inorg Chem, 14: 727-739.
9. Hashem, E. Y., et al., (2000): Spectrophotometric study of the complexation equilibria of zinc(II) with lawsone, juglone and naphthazarin, Indian Journal of Chemistry Section a-Inorganic Bio-Inorganic Physical Theoretical & Analytical Chemistry, 39: 889-895.
10. Al-Nady, A. B. M., et al., (2001): Complexation equilibria and spectrophotometric determination of thorium(IV) with lawsone, Annali Di Chimica, 91: 659-665.
11. Neves, A. P., et al., (2009): Novel Aminonaphthoquinone Mannich Bases Derived from Lawsone and their Copper(II) Complexes: Synthesis, Characterization and Antibacterial Activity, Journal of the Brazilian Chemical Society, 20: 712-+.

Poděkování: Práce byla podporována grantovým výzkumnými projekty: NANIMEL GA ČR 102/08/1546

e-mail: petr-babula@email.cz