Kombinace inhibitorů cyklin-dependentních kináz Roskovitinu a Olomoucinu II s různými chemoterapeutickými agens indukují transkripčně aktivní protein p53 u melanomových buněk.

Roskovitin a jeho nově připravený derivát Olomoucin II jsou trisubstituovaná purinová analoga, působící jako ATP-kompetitivní inhibitory cyklin-dependentních kináz (CDKs). Vykazují vysokou selektivitu vůči CDKs podílejících se na regulaci buněčného cyklu (CDK1, CDK2, CDK4) a transkripce (CDK7, CDK9). V závislosti na buněčném typu indukují zástavu buněčného cyklu v G0, G1, S a G2/M fázi spojenou následně s indukcí apoptózy. Aktivace apoptózy není přímo závislá na přítomnosti intaktního proteinu p53, přesto u wild type p53 linií je jejich působení spojeno s akumulací a stabilizací proteinu p53, a indukcí p53-dependentní transkripční aktivity. Z hlediska terapeutického využití se objevují práce prokazující synergistické nebo aditivní působení těchto látek v kombinaci s některými chemoterapeutickými agens. Z tohoto důvodu jsme se v této práci detailněji zabývali sledováním vlivu kombinací Roskovitinu a Olomoucinu II a různého genotoxického stresu na transkripční aktivaci proteinu p53.
S využitím modelu buněčné wild type p53 melanomové linie ARN8, stabilně transfekovanéreportérovým konstuktem s p53-respozivním elementem, byla nejprve sledována koncentrační závislost jednotlivých inhibitorů na schopnost aktivovat protein p53 a indukovat expresi beta-galaktosidasy. Následně byly testovány nízké koncentrace Roskovitinu a Olomoucinu II, které nevyvolávaly aktivaci proteinu p53, s terapeuticky relevantními kombinacemi běžně používaných chemoterapeutik: inhibitory topoisomerasy I (Irinotecan), inhibitory topoisomerasy II (Etoposid, Doxorubicin), alkylační agens (Cisplatina, Mitomycin C), radiominetika (Bleomycin). Působení Roskovitinu a Olomoucinu II s protinádorovými léčivy vedlo v testovaných kombinacích převážně k aktivaci proteinu p53 a synergisticky zvýšené transkripci reportérového genu. Ve většině případů nebyla zvýšená aktivita proteinu p53 při kombinovaném působení spojena se změnou jeho hladiny, ale pravděpodobně s posttranslačními modifikacemi proteinu p53. V této souvislosti imunoblot analýza neprokázala změny ve fosforylaci klíčových reziduí ovlivňujících stabilizaci a aktivaci proteinu p53 (ser15, ser392), což naznačuje, že jejich modifikace není přímo odpovědná za transaktivační stabilizaci proteinu p53. Na druhou stanu se modifikace ser15 ukazují jako klíčové pro stabilizaci proteinu p53, protože při specifické inhibici signálních drah ATM/ATR kináz, bylo detekováno významné snížení p53-dependentní transkripční aktivity při kombinovaném působení inhibitorů CDKs s chemoterapeutickými agens. Vzhledem ke složitosti studia spektra modifikací proteinu p53, komplexnosti a možnostem metodických přístupů, byly modifikace proteinu p53 zkoumány i s využitím 2D-PAGE. Analýza pomocí 2D-PAGE a následné imunodetekce identifikovala v kombinacích inhibitorů CDKs s chemoterapeutickými agens, kde byla naměřena nejvyšší aktivita reportérového genu, posun části spektra proteinu p53 směrem do kyselé oblasti. V současné době je rozpracována metodika identifikace těchto oblastí modifikovaného proteinu p53 pomocí preparativní 2D-PAGE ve spojení s hmotnostní spektrometrií.
Naše výsledky ukazují, že inhibitory CDKS Roskovitin a Olomoucin II jsou schopny potenciovat účinky chemoterapeutik a mohou se významně uplatnit v léčbě nádorových onemocnění.
Tato práce byla podpořena granty MŠMTLC06035 a MŠMT 6198959216.