KLADY A ZÁPORY NOVÉ MOLEKULÁRNÍ KLASIFIKACE NÁDORŮ PRSU

Tradiční histopatologická diagnostika karcinomu prsu využívala – a stále využívá – posouzení vzhledu a charakteru růstu nádorových buněk a v histopatologickém závěru na základě zhodnocení těchto parametrů figuruje histologický typ nádoru (duktální, lobulární, mucinózní, tubulární, atd.), charakter růstu nádoru (in situ, invazivní), histopatologický stupeň diferenciace (grade 1 - 3), vztah nádoru k cévám (lymfangioinvaze, invaze krevních cév) a k okolním strukturám (kůže, pektorální svaly). Na základě syntézy těchto údajů je vytvořena „tradiční“ histopatologická diagnóza.

Nicméně, pouhé morfologické zhodnocení není schopno poskytnout všechny relevantní informace, které jsou nutné pro volbu optimální léčebné strategie. Z morfologie není možné předpovědět předpokládanou odpověď na některé (zejména cílené) typy léčby, jako jsou blokáda hormonální osy či HER-2/neu signální dráhy. Z tohoto důvodu jsou dnes nedílnou součástí histopatologické diagnózy rovněž výsledky vyšetření exprese některých prognostických a prediktivních markerů rozhodujících o biologickém chování nádoru a odpovědi na léčbu – jmenovitě hormonálních receptorů (estrogenových – ER a progestero-nových – PR), proteinu HER-2/neu a proliferačního antigenu Ki67.

Výsledky studií zabývajících se analýzou genových expresních profilů nádorů ukázaly, že naše porozumění biologii karcinomu prsu je teprve na začátku. První práce, která se objevila v roce 2000 a identifikovala celkem 4 základní skupiny karcinomů (viz níže) a prokázala, že „profil“ nádoru je identický v různých oblastech téhož nádorového ložiska a nemění se ani během metastazování (tj. profil primárního nádoru a metastázy je prakticky identický). Autoři však upozorňují, že jsme ještě velmi daleko od získání kompletního obrázku o heterogenitě karcinomů prsu. Následovala celá řada dalších studií, které se lišily nejen počtem a spektrem analyzovaných nádorů, ale rovněž v metodice, jakým byl expresní profil zjišťován.

Přes řadu diskrepancí a rozporných závěrů z těchto studií poměrně konsenzuálně vyplývá, že karcinomy prsu tvoří několik skupin, které se od sebe navzájem signifikantně liší. Nádory lze schématicky klasifikovat na tzv. luminální (dělené různými autory do dalších podskupin, nejčastěji na luminální A a B, méně často i C či další), bazální (basal-like), a HER2 pozitivní. Existuje celá řada dalších podskupin, na kterých však mezi jednotlivými studiemi neexistuje shoda, některé je vyčleňují samostatně (např. normal - like, claudin - low, interferon - rich, apokrinní, atd.), jiné je zahrnují jako součást jedné z výše uvedených množin. Výsledky těchto molekulárně genetických studií nejsou zcela zásadně překvapivé, neboť již v minulosti byla vyslovena hypotéza podpořená i imunofluorescenčními studiemi, která tvrdila, že kmenové buňky prsní žlázy, ze kterých mohou vznikat i karcinomy prsu, mají schopnost multidivergentní diferenciace. Dva základní směry, kterými se může kmenová buňka diferencovat je směr myoepiteliální (neboli bazální) a směr luminální. Zatímco luminální buňky vykazují expresi některých typů cytoskeletálních proteinů (cytokeratiny 7, 8, 18, 19), myoepiteliální elementy exprimují markery bazálních buněk (cytokeratiny 5/6, 14, protein p63, hladkosvalový aktin, calponin apod.). Kmenová buňka se může diferencovat nejen do obou zmíněných buněčných typů, ale v rámci benigních lézí (např. duktální hyperplázie) se lze setkat i s různými přechodnými stádii, kde lze v buňce prokázat dílčí charakteristiky obou pólů spektra.

Luminální buňky hrají stěžejní roli v produkci součástí mléka, proto jsou přímo ovlivňovány pohlavními hormony a exprimují ve svém jádře hormonální receptory, zatímco buňky bazální expresi těchto receptorů postrádají. Není tedy překvapivé, že jedním z hlavních znaků luminálních karcinomů je právě exprese ER a PR, zatímco karcinomy bazální spadají prakticky výhradně do kategorie tzv. triple negativních nádorů (tedy ER-, PR- a HER2-).

Pro některé kategorie karcinomů prsu (např. HER2 pozitivní) ale neexistuje protipól v oblasti benigních lézí a tento fenotyp je pozorován výhradně v rámci maligních nádorů.

Pro klinickou praxi všedního dne vyplývají z těchto studií některé zásadní závěry:

1. jen naprosto výjimečně dochází k tomu, aby nádor původně spadající do jedné ze subkategorií „konvertoval“ v recidivě či metastáze do subkategorie jiné. To však neznamená, že se nádory během svého vývoje nijak nemění – je známo, že v důsledku terapeutického ovlivnění dochází ke změnám v proliferační aktivitě (ta je po systémové léčbě výrazně nižší), v rámci dediferenciace mohou nádory původně hormonálně dependentní ztrácet expresi hormonálních receptorů, apod.
2. Super sofistikovanou a stále ještě velmi nákladnou klasifikaci pomocí analýzy expresních profilů několika desítek genů lze v běžném životě velmi dobře nahradit imunohistochemickým vyšetřením několika málo klinicky relevantních markerů – ER, PR, Ki67, HER-2/neu, p53. Výsledek tohoto vyšetření není ekvivalentní stanovení genového expresního profilu, pokud je však imunohistochemie provedena v dobře fungující laboratoři a z reprezentativního vzorku tkáně, postačují získané informace pro kvalifikované terapeutické rozhodnutí.
3. spolehlivost molekulárně-genetické analýzy specializovanými testy (OncotypeDX, MammaPrint, apod.) je ohrožena důsledky neadekvátního zacházení s odebranou nádorovou tkání naprosto stejně, jako výše uvedené imunohistochemické vyšetření. Alfou a omegou pro získání validních informací z nádoru je dodržení tzv. preanalytické fáze – tedy zejména rychlé a optimální fixace tkáně.

V histopatologické diagnostice karcinomu prsu existuje stále řada velmi ožehavých témat, která souvisejí s několika fakty. Prvním z nich je skutečnost, že nádorová tkáň je velmi nestabilní a vyžaduje přísné dodržování šetrného zacházení během tzv. preanalytické fáze – tedy dobou mezi odběrem (punkcí biopsie, chirurgickým zákrokem) a vlastním histologickým zpracováním. Čas mezi odběrem a fixací, dostatečné množství a správný typ fixační tekutiny i celková délka fixace mají zásadní vliv na zachování tkáňových antigenů detekovaných pomocí imunohistochemie, jako jsou hormonální receptory, proliferační antigen Ki67 či onkoprotein HER-2/neu či in situ hybridizace (amplifikace HER-2/neu či topoizomerázy 2alfa). Nedodržení postupů preanalytické fáze tak může i při následném bezchybném histologickém zpracování vést k naprosto zavádějícím falešně negativním závěrům. Např. z prognosticky příznivého hormonálně dependentního nádoru (ER+/PR+/HER2-) se tak kvůli falešné negativitě průkazu steroidních receptorů rázem stává prognosticky velmi nepříznivý karcinom triple negativní (ER-/PR-/HER2-)!

Druhou velmi kontroverzní oblastí je limitace vyšetření prognostických a prediktivních markerů v malých bioptických vzorcích (typicky core cut biopsie) v důsledku heterogenity nádorové populace. Typickým příkladem může být detekce proliferačního antigenu Ki67. Vyšetření proliferační aktivity pomocí tohoto markeru je v dnešní době považováno za jeden z klíčových faktorů při rozhodování o volbě terapie, Ki67 je prokazatelně nejen markerem prognostickým (nádory s vyšším Ki67 indexem se chovají agresivněji), ale rovněž prediktivním (lepší odpověď na chemoterapii i hormonální léčbu lze předpokládat u nádorů s vyšší proliferací). Přitom proliferační aktivita nádoru (potažmo exprese Ki67) je velmi nehomogenní, s maximem na periferii nádorového ložiska.

Publikované studie ukazují, že konkordance ve stanovení Ki67 je i mezi experty na mamární patologii nízká, a to zejména u nádorů středně diferencovaných (G2), kde má přitom správné zhodnocení proliferační aktivity největší význam při klinickém rozhodování. Pokud k metodickým úskalím, jež jsou vlastní hodnocení tohoto parametru jako takového (dodržení všech požadavků preanalytické fáze, volba vhodné imunohistochemické metody, zkušenost při vyhodnocení), přibude ještě další faktor nejistoty způsobený limitovanou velikostí vzorku, lze brát výpovědní hodnotu Ki67 indexu jako pouze hrubě orientační a nelze do tohoto parametru vkládat nepřiměřená očekávání. V tomto kontextu působí jako velmi naivní snaha o stanovení jedné plošně platné prahové hodnoty (20%) na odlišení nízce a vysoce proliferujících nádorů, tak jak k tomu došlo na letošním kongresu v St. Gallen. Při znalosti úskalí, která provázejí stanovení Ki67 indexu, je třeba si uvědomit, že v době medicíny založené na důkazech se biologický potenciál nádoru opravdu nedá stanovit na základě arbitrární hodnoty cut - off určené hlasováním expertů.

Obdobně nehomogenní je také exprese hormonálních receptorů v některých nádorech, více toto platí pro receptory progesteronové, než estrogenní. Naproti tomu exprese HER-2/neu je podstatně více homogenní, i když i zde se lze ojediněle setkat s nádory s heterogenní populací neoplastických buněk. Proto je obecně doporučováno v případech, kde je to možné, v případě negativity některého markeru (ať již ER/PR či HER2) v bioptickém vzorku, zopakování vyšetření z definitivního resekátu.

Závěrem lze tedy shrnout, že kvalifikovaně se rozhodnout o optimálním typu péče pro pacientku s karcinomem prsu je možné pouze tehdy, pokud je splněno několik základních podmínek. Na prvním místě musí fungovat kvalitní mezioborová spolupráce a zcela hladká komunikace, která zajistí přenos informací v plném rozsahu (tedy nikoli pouze „hodnotu“ ve výsledkovém protokolu, ale zasazení jednotlivých parametrů do celkového kontextu s vědomím si všech možných limitací vyšetření). Druhým nezbytným předpokladem je optimalizace zpracování nádorové tkáně jak na straně klinické (dodržení preanalytické fáze), tak na straně patologa (kontrola kvality práce laboratoře, validace všech použitých metod, používání certifikovaných kitů tam, kde je to možné). Třetím předpokladem je uvědomění si, že přes všechen rozvoj moderních technologií a laboratorních metod, je patologie stále oborem do velké míry expert - dependentním, tedy zatíženým značnou mírou subjektivity. Z tohoto důvodu je vhodné v případě nálezů, které jsou z jakéhokoli důvodu nějakým způsobem kontroverzní/nejisté/pochybné, využívat institutu „druhého čtení“ – tedy opakovaného vyšetření na jiném pracovišti patologem, který má s danou problematikou pokud možno co největší zkušenosti. Na tomto místě je třeba s potěšením konstatovat, že tato praxe je na většině pracovišť patologie v České republice zcela běžným standardem.

Literatura:

1. Bussolati G, Leonardo E: Technical pitfalls potentially affecting diagnoses in immunohistochemistry. J Clin Pathol 2008, 61:1184-1192.
2. Dowsett M, Cuzick J, Wale C, et al: Prediction of risk of distant recurrence using the 21-gene recurrence score in node-negative and node-positive postmenopausal patients with breast cancer treated with anastrozole or tamoxifen: A TransATAC study. J Clin Oncol 28:1829-1834, 2010
3. Dowsett M, Nielsen TO, A’Hern R, Bartlett J, Coombes RC, et al. (2011) Assessment of Ki76 in breast cancer: recommendations from the international Ki67 in breast cancer working group. J Natl Cancer Inst 103: 1656–1664.
4. Dowsett M, Smith IE, Ebbs SR, Dixon JM, Skene A, et al. (2007) Prognostic value of Ki67 expression after short-term presurgical endocrine therapy for primary breast cancer. J Natl Cancer Inst 99: 167–170.
5. Marchio et al.: Revisiting the technical validation of tumour biomarker assays: how to open a Pandora’s box. BMC Medicine 2011 9:41.
6. Miller K, Ibrahim M, Barnett S, Jasani B: Technical aspects of predictive and prognostic markers in breast cancer: what UK NEQAS data show. Curr Diagn Pathol 2007, 13:135-149.
7. Perou CM, Sorlie T, Eisen MB, et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature 2000;406:747-52.
8. Pusztai L, Mazouni C, Anderson K, Wu Y, Symmans WF. Molecular classification of breast cancer: limitations and potential. Oncologist 2006; 11; 868–877.
9. Sorlie T, Perou C, Tibshirani R et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98; 10869–10874. 13. Sorlie T, Tibshirani R, Parker J et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100; 8418–8423.
10. Sorlie T, Wang YL, Xiao CL et al. Distinct molecular mechanisms underlying clinically relevant subtypes of breast cancer: gene expression analyses across three different platforms. BMC Genomics 2006; 7; 127.
11. Sotiriou C, Pusztai L: Gene-expression signatures in breast cancer. N Engl J Med 2009, 360:790-800.
12. Sotiriou C, Wirapati P, Loi S, Harris A, Fox S, et al. (2006) Gene expression profiling in breast cancer: understanding the molecular basis of histologic grade to improve prognosis. J Natl Cancer Inst 98: 262–272.
13. van de Vijver MJ, He YD, van ’t Veer LJ, et al. A gene expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 2002;347:1999–2009.
14. van’t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 2002; 415; 530–536.
15. Varga Z, Diebold J, Dommann-Scherrer C, Frick H, Kaup D, et al. (2012) How Reliable Is Ki-67 Immunohistochemistry in Grade 2 Breast Carcinomas? A QA Study of the Swiss Working Group of Breast- and Gynecopathologists. PLoS ONE 7(5): e37379. doi:10.1371/journal.pone.0037379
16. Viale G, Giobbie-Hurder A, Regan MM, Coates AS, Mastropasqua MG, et al. (2008) Prognostic and predictive value of centrally reviewed Ki-67 labeling index in postmenopausal women with endocrine-responsive breast cancer: results from Breast International Group Trial 1–98 comparing adjuvant tamoxifen with letrozole. J Clin Oncol 26: 5569–5575.