Jednoduché a rychlé rozlišení nativní a denaturované formy proteinů

Proteiny hrají v živých organizmech velmi významné a nezastupitelné role. Při poškození organizmu vlivem stresových faktorů může docházet, podobně jako ke změnám na úrovni řetězce nukleové kyseliny, také i ke strukturním změnám proteinů. To může indukovat narušení biologicky významných cest a vést tak až k zániku celého organizmu. Mezi proteiny, jejichž funkce se významným způsobem pojí se strukturou, patří laktoferin. Laktoferin, jenž je také nazýván laktotransferin, byl objeven v roce 1939 v kravském mléku. Jeho jméno je odvozeno podle dřívější klasifikace jako nejvýznamnější železo vázající bílkovina v mléce. V roce 1960 byl poprvé izolován z lidského mateřského mléka. V minulosti byl považován laktoferin pouze za bakteriostatický železo-transportní protein v mléku. Následně se také ukázal velmi významným železo vázajícím proteinem dalších exokrinních sekretů jako jsou žluč, pankreatická šťáva a střevní sekrety.
Strukturně a chemicky je laktoferin glykoprotein skládající se z 703 aminokyselinových zbytků. Jeho molekulová hmotnost se pohybuje kolem 77 000 Da. Mezi doposud známé biologické funkce laktoferinu patří regulace homeostázy železa. Zajímavý je vztah k regulaci buněčného růstu, diferenciaci buněk a protizánětlivé aktivitě. Z toho také vyplývá možný vztah ke zhoubným dorům a procesu metastazování.
V této práci jsme studovali základní elektrochemické chování laktoferinu pomocí stacionární a průtokové elektrochemické techniky se zaměřením na studium změny struktury proteinu. Nejdříve jsme optimalizovali detekční techniku a dosáhli jsme detekčního limitu stovky 100 nM studovaného proteinu. V dalších experimentech byla sledována změna signálu laktoferinu v přítomnosti různých fyzikálních nebo chemických činitelů vedoucích ke změně struktury. Konkrétně jsme sledovali vliv teploty, methanolu a močoviny po dobu tří hodin. Z našich výsledků je patrné, že jsme schopni pomocí naší techniky sledovat strukturní změny laktoferinu.
V práci je ukázáno že elektrochemická analýza je použitelná nejen pro stanovení ale i pro studium změny struktury proteinu. Elektrochemické techniky tak představují alternativní nástroj pro detekci biologicky aktivních látek především pro svoji jednoduchost, relativně nízkou cenu, rychlost a spolehlivost.
Poděkování: Tato studie byla podporována granty Ligy proti rakovině 2006, Radanal 1/2006 a MSMT 6215712402.

Literatura

1. Potesil D, Mikelova R, Adam V, Kizek R and Prusa R. Change of the protein p53 electrochemical signal according to its structural form – quick and sensitive distinguishing of native, denatured, and aggregated form of the „Guardian of the Genome“, Protein J. 25 (2006) 23R–32.