Konference: 2004 XXVIII. Brněnské onkologické dny a XVIII. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Onkologická diagnostika
Téma: Molekulární a laboratorní diagnostika nádorů
Číslo abstraktu: 19
Autoři: prof. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D.; J. Pacholíková; MUDr. Pavel Fabián, Ph.D.; Ing. Dana Dvořáková, CSc.
Úvod
Tkáně fixované ve formalínu a archivované v parafinových bločcích, jsou nejdostupnějším materiálem pro retrospektivní klinické studie. Význam tohoto zdroje narůstá v souvislosti s potřebou validace nově determinovaných diagnostických a prognostických markerů, jejichž výpovědní hodnotou je míra genové exprese.
Kvantitativní analýza genové exprese je v současnosti nejčastěji prováděna pomocí Quantitative Real-Time PCR (QRT-PCR) a DNA čipů. Tyto metody vyžadují dostatečné množství kvalitní RNA, což v případě jednoho DNA čipu znamená 10-50 ěg celkové RNA. Problém izolace RNA z tkání archivovaných v parafinu spočívá zejména v její nepoužitelnosti pro vysoký stupeň degradace. K ní dochází především v mezidobí od získání tkáně do završení její fixace. Pro tento účel nevhodná formalínová fixace způsobuje navíc tvorbu tzv. „cross-linking“ vazeb mezi nukleovými kyselinami a proteiny a kovalentně modifikuje RNA. Náročnost izolace kvalitní RNA z parafinových bločků za účelem kvantitativního hodnocení genové exprese dokresluje i to, že dosud byla ve světové literatuře publikována pouze jediná práce popisující takový postup.
Výsledky
V naší práci prezentujeme vlastní způsob izolace RNA, který jsme úspěšně vyzkoušeli u 40 vzorků tkání fixovaných ve formalinu a archivovaných v parafinových bločcích. Stáří bločků se pohybovalo v rozmezí 1 až 29 let, RNA získaná z cca 8 řezů o šířce 8 ěm dosahovala po nezbytném ošetření DNasou I průměrné koncentrace 330 ng/ěl a indexu absorbance A260/280 1,68+/-0,16. Elektroforéza prokázala ve všech případech určitý stupeň degradace RNA, nicméně byla vždy zachována zřetelná detekce 28S i 18S rRNA. Vyizolovaná RNA byla velmi úspěšně použita k RT-PCR a QRT-PCR. Výsledky QRT-PCR kvantifikující expresi sledovaného genu byly ve shodě s výsledky semikvantitativního imunohistochemického hodnocení korespondujícího proteinu (t-test: p = 0,003). Před izolací RNA jsme ustoupili od deparafinizace, která neovlivnila výtěžnost, nicméně snižovala kvalitu RNA. Lyzační roztok byl založen na Proteinase K, obsahoval inhibitory RNAsy a doba lyzace činila 12 hodin při teplotě 60°C. K samotné izolaci jsme použili v modifikovaném postupu Trizol.
Závěr
Vlastním protokolem jsme provedli úspěšnou izolaci RNA z tkání fixovaných formalínem a archivovaných v parafinových bločcích. RNA dosahovala dostatečného množství a kvality k použití pro RT-PCR a QRT-PCR. Zda ji bude možné využít i pro DNA čipy testujeme v současnosti.
Tkáně fixované ve formalínu a archivované v parafinových bločcích, jsou nejdostupnějším materiálem pro retrospektivní klinické studie. Význam tohoto zdroje narůstá v souvislosti s potřebou validace nově determinovaných diagnostických a prognostických markerů, jejichž výpovědní hodnotou je míra genové exprese.
Kvantitativní analýza genové exprese je v současnosti nejčastěji prováděna pomocí Quantitative Real-Time PCR (QRT-PCR) a DNA čipů. Tyto metody vyžadují dostatečné množství kvalitní RNA, což v případě jednoho DNA čipu znamená 10-50 ěg celkové RNA. Problém izolace RNA z tkání archivovaných v parafinu spočívá zejména v její nepoužitelnosti pro vysoký stupeň degradace. K ní dochází především v mezidobí od získání tkáně do završení její fixace. Pro tento účel nevhodná formalínová fixace způsobuje navíc tvorbu tzv. „cross-linking“ vazeb mezi nukleovými kyselinami a proteiny a kovalentně modifikuje RNA. Náročnost izolace kvalitní RNA z parafinových bločků za účelem kvantitativního hodnocení genové exprese dokresluje i to, že dosud byla ve světové literatuře publikována pouze jediná práce popisující takový postup.
Výsledky
V naší práci prezentujeme vlastní způsob izolace RNA, který jsme úspěšně vyzkoušeli u 40 vzorků tkání fixovaných ve formalinu a archivovaných v parafinových bločcích. Stáří bločků se pohybovalo v rozmezí 1 až 29 let, RNA získaná z cca 8 řezů o šířce 8 ěm dosahovala po nezbytném ošetření DNasou I průměrné koncentrace 330 ng/ěl a indexu absorbance A260/280 1,68+/-0,16. Elektroforéza prokázala ve všech případech určitý stupeň degradace RNA, nicméně byla vždy zachována zřetelná detekce 28S i 18S rRNA. Vyizolovaná RNA byla velmi úspěšně použita k RT-PCR a QRT-PCR. Výsledky QRT-PCR kvantifikující expresi sledovaného genu byly ve shodě s výsledky semikvantitativního imunohistochemického hodnocení korespondujícího proteinu (t-test: p = 0,003). Před izolací RNA jsme ustoupili od deparafinizace, která neovlivnila výtěžnost, nicméně snižovala kvalitu RNA. Lyzační roztok byl založen na Proteinase K, obsahoval inhibitory RNAsy a doba lyzace činila 12 hodin při teplotě 60°C. K samotné izolaci jsme použili v modifikovaném postupu Trizol.
Závěr
Vlastním protokolem jsme provedli úspěšnou izolaci RNA z tkání fixovaných formalínem a archivovaných v parafinových bločcích. RNA dosahovala dostatečného množství a kvality k použití pro RT-PCR a QRT-PCR. Zda ji bude možné využít i pro DNA čipy testujeme v současnosti.
Datum přednesení příspěvku: 26. 5. 2004
