Intracelulární vychytávání elipticinu – příčina chemorezistence a možnost zesílení účinku?

   Úvod

   Elipticin (EL) (5,11-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole) je alkaloid izolovaný z rostlin čeledi toješťovitých. Některé jeho rozpustné deriváty (9-hydroxyellipticine, 9-hydroxy-N2-methyl-ellipticinium, 9-chloro-N2-methyl-ellipticinium and 9-methoxy--N2-methyl-ellipticinium) vykazují protinádorové účinky a v některých zemích byly používány k terapii karcinomu prsu, zvláš- tě s generalizací do skeletu a AML (Rouesse et al 1993; Kizek 2012). Hlavním důvodem zájmu o tuto skupinu cytostatik je jejich vysoká účinnost proti některým typům nádorů, relativně nízké vedlejší účinky a nepřítomnost hematotoxicity. Bylo prokázáno, že EL zastavuje buněčný cyklus snížením exprese cyklinu B1 a Cdc2 a zvýšením exprese p21. Indukuje apoptózu tvorbou volných kyslíkových radikálů, narušením oxidativní fosforylace v mitochondriích, aktivací systému Fas/Fas ligand, iniciací mitochondriální apoptotické dráhy a regulací apoptotických proteinů Bcl-2, Bcl-XL. XIAP a Bax. Byla prokázána účinnost EL a některých jeho derivátů na buňky s mutovaným p53 (mutace v DNA vazebné doméně) (Peng et al., 2003). Předpokládáme, že hlavním mechanismem protinádorového účinku EL je interkalace do struktury DNA, inhibice aktivity topoisomerázy II a zvláště tvorba kovalentních DNA adduktů. Pro účinnost EL a tvorbu kovaletních DNA adduktů je nezbytná jeho aktivace cytochromy P450 / CYP / nebo peroxidázami. Proto jeho cytotoxický a genotoxický účinek závisí na obsahu těchto enzymů v cílových tkáních a buňkách (Poljaková et al., 2009)). Relativně vyšší exprese těchto enzymů v nádorových buňkách oproti buňkám normálních tkání je pravděpodobně odpovědná za určitou protinádorovou specificitu účinků EL a jeho derivátů.

  Chemorezistence je jednou z hlavních příčin selhání terapie nádorů. Nádorové buňky mohou být k cytostatiku rezistentní primárně nebo se jejich rezistence vyvíjí v průběhu protinádorové léčby. Rezistence nádorových buněk k cytostatiku je většinou vyvolána kombinací více různých mechanizmů (Procházka et al, 2012). Hlavní mechanismy jsou: (i) zvýšené vylučování léku z buňky; (ii) ovlivnění exprese cílové struktury nebo její změny; (iii) změny enzymů, které lék aktivují nebo jej detoxikují; (iv) indukce antiapoptotických nebo inhibice proapoptotických mechanizmů; (v) změny metabolizmu nebo vylučování léku v organizmu nebo jeho snížená dostupnost nádorovým buňkám (Bedrníček et al, 2005). Jedním z popsaných mechanizmů je „vychytá- ní“ léku v cytoplasmatických vezikulách (interakce s proteiny), což zabrání jeho působení na cílové struktury v buňce. U buněk linie U-937 odvozené od AML s experimentálně navozenou rezistencí k doxorubicinu bylo popsáno vychytávání tohoto léku v lysosomech (Hurwitz et al, 1997). Dále však nebylo vychytávání léků v lysosomech příliš studováno. Vychytávání látek v buňkách je zavislé na jejch pK (konstanta acidity). Bazické látky (vysoká pK) na základě pH gradientu přestupují do kompartmentů s nízkým pH, kde dochází k jejich protonaci. Tento mechanizmus, také označováný termínem „ione trapping“ byl popsán u některých léčiv (lidokain, amidaron). Vakuolární (V)-ATPázy jsou ATP dependentní protonové pumpy a mají zásadní význam v regu- laci pH buněk, buněčných intracelulárních kompartmentů (lysosomy, endozomy, peroxisomy, Golgiho komplex, sekreční granu- la) a intercelulárních prostorů. V-ATPázy udržují realativně neutrální intracelulární pH, kyselé luminální a kyselé extracelulární. V souvislosti s metabolismem nádorových buněk (metabolismus glukózy, hypoxie, nedostatečná vaskularizace nádorové tkáně) dochází k výrazné acidifikaci extracelulárního prostoru a intracelulárních kompartmentů. Snížení extracelulárního pH se prostřednictvím aktivace proteáz (MMP-2, MMP-9, katepsiny) podílí na metastázování buněk a indukci angiogeneze, nižší luminální pH se podílí na vychytávání protinádorových léčiv. Zvýšená exprese V-ATPáz byla popsána v souvislosti s chemorezistencí, progresí nádorů, zvýšenou invazivitou a metastazováním (Pérez-Sayáns et al, 2009).

   Metody

   Buněčné linie: odvozené od neuroblastomu SK-N-AS – bez amplifikace MYCN, UKF-NB-4 – s amplifikací MYCN, UKF- NB-4ELLI – s experimentálně navozenou rezistencí k EL, kterou jsme připravili v laboratoři KDHO.

   Apoptóza: vazba značeného AnexinuV a DAPI hodnocená průtokovou cytometrií. Hodnocení účinku cytostatika: MTT test a výpočet IC50.

   Detekce EL v buňkách: EL má fluorescenční (obdobné jako FITC) a redoxní vlastnosti, detekce fluorescenční mikroskopií, průtokovou cytometrií a laserovou skenovací mikroskopií. Koncentrace EL byla detekována diferenční pulzní voltametrií.

   Průkaz autofagie: detekce proteinu LC-3 Western blotingem a elektronová mikroskopie.

   Expresní mikroarray: celková RNA byla izolována a nanesena na array, po hybridizaci byla měřena fluorescence.

   Výsledky a diskuze

   Neuroblastomové buňky (linie UKF-NB-4, UKF-NB-4ELLI a SK-N-AS) vytváří při kultivaci s EL již během jedné hodiny vakuoly, které obsahují EL (byla pozorována fluorescence vakuol). Elektronová mikroskopie ani průkaz pouze minimální konverze LC-3 I na LC-3 II nesvědčili pro autofagii, kterou jsme při nálezu vakuol v inverzním mikroskopu zpočátku předpokládali.

  U linie UKF-NB-4ELLI rezistentní k EL jsme metodou expresní mikroarray prokázali zvýšenou expresi V-ATPázy (Procházka et al, 2012). Jejich overexprese byla již dříve popsána u jiných chemorezistentních linií (Murakami et al, 2001). V-ATPázy jsou proteiny membrány lysosomů, který umožňuje funkci protonové pumpy, ta transportuje protony dovnitř lysosomu a udržuje stabilní pH 4,8 (tedy kyselejší než v cytoplasmě). Předpokládá se, že V-ATPáza má i antiapoptotický efekt. Pro účast vychytávání léku v lysosomech na rezistenci k EL svědčí i fakt, že fluorescence celých buněk rezistentní i senzitivní linie kultivovaných v mediu s EL byla stejná, ale významně nižší (o 60 %) byla fluorescence jader rezistentní linie ve srovnání se senzitivní linií. Odstranění EL v lysosomech rezistentních buněk tedy pravděpodobně snížilo koncentraci EL v cytosolu a což vedlo k poklesu transportu EL do buněčného jádra, které je cílovou strukturou.

   Náš experimentální výzkum se zaměřil na možnosti ovlivnění účinku EL vybranými sloučeninami ovlivňujícími V-ATPázy. Bafilomycin je specifický inhibitor V-ATPázy a inhibuje tak acidifikaci lysosomů a endosomů a inhibuje autofagii zábranou fúze autofagosomů s lysosomy. Chlorochin je známé antimalarikum, ale má i účinky obdobné jako bafilomycin (zvyšuje lysozomální pH a inhibuje fúzi autofagosomů s lysosomy) i když působí méně specificky. Wortmanin je specifický inhibitor phosphoinositid 3-kináz, který blokuje časná stadia autofagie, ale neovlivňuje lysosomální pH ani aktivitu V-ATPáz. Kombinace EL s bafilomycinem nebo s cholorichinem zvýšila indukci apoptózy u senzitivní i rezistentní linie. Obdobný efekt však nevykazoval wortmanin. Z toho tedy vyplývá, že účinek EL je inhibován vychytáváním v lysozomech a ne autofagií.

  Závěry

   Naše výsledky ukazují, že na rezistenci k EL se významně podílí vychytávání léku v lysosomech. Inhibicí V- ATPázy lze tuto rezistenci potlačit. Lze proto předpokládat, že inhibitory V-ATPázy mohou potencovat účinek některých cytostatik.

Literatura

1. Hurwitz SJ, Terashima M, Mizunuma N, Slapak CA. Vesicular anthracycline accumulation in doxorubicin-selected U-937 cells:participation of lysosomes. Blood. 1997;89(10):3745-54.
2. Kizek R, Adam V, Hrabeta J, Eckschlager T, Smutny S, Budra JV, Frei E, Stiborova M. Anthracyclines and ellipticines as DNA-damaging anticancer drugs: Recent advances. Pharmacology and Therapeutics. 2012;133:26-39.
3. Murakami T, Shibuya I, Ise T, Chen ZS, Akiyama S, Nakagawa M, Izumi H, Nakamura T, Matsuo K, Yamada Y, Kohno K. Elevated expression of vacuolar proton pump genes and cellular PH in cisplatin resistance. Int J Cancer. 2001; 93: 869-74.
4. Peng Y, Li C, Chen L, Sebti S, Chen J. Rescue of mutant p53 transcription function by ellipticine. Oncogene. 2003;22(29):4478-87.
5. Pérez-Sayáns M, Somoza-Martín JM, Barros-Angueira F, Rey JM, García-García A V-ATPase inhibitors and implication in cancer treatment. Cancer Treat Rev. 2009;35(8):707-13
6. Poljaková J, Eckschlager T, Hrabeta J, Hrebacková J, Smutný S, Frei E, Martínek V, Kizek R, Stiborová M. The mechanism of cytotoxicity and DNA adduct formation by the anticancer drug ellipticine in human neuroblastoma cells. Biochem Pharmacol. 2009;77(9):1466-79.
7. Procházka P, Libra A, Zemanová Z, Hřebačková J, Poljaková J, Hraběta J, Bunček M, Stiborová M, Eckschlager T. Mechanisms of ellipticine-mediated resistance in UKF-NB-4 neuroblastoma cells. Cancer Sci, 2012 in press
8. Rouëssé J, Spielmann M, Turpin F, Le Chevalier T, Azab M, Mondésir JM.Phase II study of elliptinium acetate salvage treatment of advanced breast cancer. Eur J Cancer. 1993;29A(6):856-9
9. Spugnini EP, Citro G, Fais S. Proton pump inhibitors as anti vacuolar-ATPases drugs: a novel anticancer strategy. J Exp Clin Cancer Res. 2010;29:44

Poděkování: práce vznikla za finanční podpory GA ČR (grant P301/10/0356) a CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.