Interakce vysoce nenasycených mastných kyselin a butyrátu při působení na buňky adenokarcinomu kolonu.

Epitel lidského střeva představuje neustále se obnovující tkáň sloužící k zajištění mnoha kritických fyziologických funkcí organismu. Dynamická rovnováha mezi přírůstkem buněk na bázi kolonových krypt a buněčnou smrtí diferencovaných buněk na jejich povrchu (apoptóza-anoikis), je přísně regulována řadou ;endogenních faktorů jako jsou cytokiny a hormony je však významně ovlivňována rovněž exogenními faktory přicházejícími do střeva s potravou. Patří mezi ně zejména tuky a vláknina, jejichž obsah v dietě může významným způsobem ovlivňovat chování střevních epiteliálních buněk [1]. Na jedné straně mohou podporovat vznik infekčních, zánětlivých a neoplastických onemocnění a na druhé straně mohou přispívat k regeneraci poškozené tkáně a být využívány v terapii.

Vysoce nenasycené mastné kyseliny v karcinogenezi
Z řady experimentálních i epidemiologických studií vyplývá, že že lipidové složky výživy mohou hrát důležitou úlohu v etiologii nádorů tlustého střeva [2, 3]. Ukazuje se, že kromě navozeného zvýšeného energetického příjmu se zde uplatňuje i kvantitativní a kvalitativní zastoupení esenciálních vysoce nenasycených mastných kyselin (VNMK) . Důležitý je zejména poměr n-3 a n-6 VNMK [4]. Uvádí se, že zatímco živočišný tuk a rostlinné oleje bohaté na kyselinu linolovou (18:2, n-6) mohou podporovat rozvoj nádorů kolonu, příjem zvýšeného množství n-3 VNMK (obsažených zejména v rybím tuku) může inhibovat nádorový růst a snižovat tvorbu metastáz. PUFA třídy n-3 mohou navíc velmi významně ovlivnit další energetické parametry a tím i nádorovou kachexii [5].
VNMK si organismus nedovede syntetizovat a jejich dostupnost je tak závislá na přísunu z vnějšího prostředí ve formě potravy. Tím může docházet ke změnám ve složení buněčných membrán, která může být zcela nezávislá na genomu. Hlavní úlohu sehrávají tyto látky zvláště v promoční fázi karcinogeneze, ale byla prokázána jejich důležitá role i při tvorbě metastáz. V iniciačních procesech zejména při aktivaci prokarcinogenů mohou hrát úlohu některé enzymatické systémy spojené s metabolismem VNMK, především prostaglandin H syntáza nebo cytochromy P-450.

Jako složky membránových fosfolipidů a díky svým strukturálním a fyzikálním vlastnostem, mohou VNMK měnit strukturální a funkční vlastnosti membrán. Změny spektra mastných kyselin v membránových strukturách mají dopad nejen na membránovou fluiditu, ale zejména na interakce receptorů s jejich ligandy a další membránou zprostředkované buněčné funkce [6]. VNMK tak hrají důležitou úlohu v přenosu signálů z mimobuněčného prostoru a fungují jako intrai intercelulární mediátory a modulátory buněčné signalizační sítě [7].
Kromě změn na membránách je hlavní pozornost výzkumu věnována dále změnám v oxidativním metabolismu, tj. produkci reaktivních metabolitů kyslíku (ROS) a dusíku a peroxidaci lipidů, modulaci uvolňování biologicky aktivních mediátorů – eiko-sanoidů a kontrole dějů v buněčném jádře, tj. interakcím s vnitrobuněčnými receptory a účinkům na transkripci genů [8]. Působení VNMK na různých úrovních buněčné organizace a jejich interakce s dalšími endogenními nebo exogenními faktory může ve svém důsledku významně ovlivňovat proliferaci, diferenciaci a apoptózu střevních epiteliálních buněk [9].

Mastné kyseliny s krátkým řetězcem – butyrát
Dalším důležitým faktorem ovlivňujícím chování epiteliálních buněk kolonu jsou mastné kyseliny s krátkým řetězcem, zejména butyrát, tvořený v gastrointestinálním traktu savců anaerobní bakteriální fermentací vlákniny. Je prokázáno, že zatímco pro normální epiteliální buňky je butyrát zdrojem energie a stimuluje růst, u nádorových buněk naopak inhibuje proliferaci a indukuje diferenciaci a apoptózu [10]. Vzhledem k tomu, že při rozvoji kolorektálních nádorů hrají důležitou úlohu změny homeostázy epiteliální vrstvy mukózy, na nichž se kromě proliferace podílí i suprese apoptózy, může být butyrát považován za účinnou látku v prevenci a terapii tohoto nádorového onemocnění. Mechanismy účinku nejsou ještě zdaleka objasněny. Kromě jiného funguje butyrát jako inhibitor histon deacetyláz, což vede k rozvolňování nukleozomální DNA a k selektivním změnám genové exprese [11].
Z uvedeného vyplývá, že lipidové složky potravy mohou mít významné účinky na udržování homeostázy na úrovni buněčných populací a tak se mohou podílet na vzniku patologických stavů včetně rozvoje některých nádorových onemocnění. Dosud však bylo obtížné prokázat přímo jejich klinické účinky. Slibným přístupem, podobně jako v případě klasické terapie, jsou úvahy o kombinovaném působení složek výživy. Čím lépe budou objasněny dráhy a procesy, kterými mohou lipidy ovlivňovat buněčné funkce, tím lépe bude možné porozumět účinkům jednotlivých nutričních složek na lidské zdraví a využít je v prevenci a terapii.
Naše výsledky ze studia účinků kyselin s krátkým řetězcem (butyrát) i VNMK a modulace jejich metabolismu u modelových nádorových populací (odvozených od lidských krevních a střevních epiteliálních buněk nebo myšího fibrosarkomu) prokázaly významné účinky těchto látek na proliferaci, diferenciaci a apoptózu a na ovlivnění důležitých signálních drah. Prokázali jsme rovněž posílení apoptózy a modulaci diferenciace u nádorových buněk střeva po kombinaci kyseliny arachidonové (AA) a dokosahexaenové (DHA) s butyrátem [12] či induktory apoptózy rodiny TNF (faktor nekrotizující nádory) [13, 14] a kombinaci butyrátu s TNF [15]. V současné době je náš výzkum zaměřen na objasňování detailních mechanismů těchto interakcí.

Změny buněčných lipidů v průběhu diferenciace a apoptózy střevních buněk po kombinovaném působení VNMK a butyrátu
Detekce modulací ve složení, struktuře, symterii a metabolismu buněčných lipidů a jejich korelace s dalšími parametry odrážejícími proliferaci, diferenciaci a apoptózu může přispět k objasnění posloupnosti a regulace jednotlivých kroků těchto dějů, rozdílů mezi normálními a nádorovými buňkami i příčin rezistence nádorových buněk k terapii.
Modelové buněčné linie odvozené od lidského adenokarcinomu kolonu (HCT-116 a HT-29 byly ovlivněny AA (20:4, n-6;
50 µM), DHA (22:6, n-3; 50 M), butyrátem sodným (NaBt 3; mM) nebo jejich kombinacemi. V průběhu kultivace (24-72 h) byly s využitím průtokové cytometrie (FCM) a dalších metod (fluorimetrie, fluorescenční mikroskopie, spektrometrie, gelová elektroforéza) sledovány strukturální změny membránových lipidů (lipid packing) pomocí merocyaninu (MC) 540 [16], akumulace triglyceridů v cytoplazmě buněk pomocí Nile Red [17], parametry odrážející proliferaci (počty buněk, buněčný cyklus), diferenciaci (aktivita alkalické fosfatázy) a buněčnou smrt (% plovoucích buněk, viabilita, apoptóza – morfologické hodnocení fluorescenční mikroskopií po barvení buněk DAPI, subG0/G1 populace). Kromě toho byly sledovány také změny produkce ROS (DHR-123), transmembránového mitochondriálního potenciálu (TMRE), aktivita kaspázy-3 a -9, štěpení PARP a změny exprese některých proteinů spjatých s regulací cytokinetiky (Western blotting).
Výsledky ukázaly, že po kombinovaném působení AA či DHA s NaBt dochází u buněk HCT116 i HT-29 k významné modulaci účinků ve srovnání s látkami aplikovanými samostatně.
AA a DHA v použité koncentraci významně neovlivňovaly proliferaci a neindukovaly buněčnou smrt. Byla pozorována pouze zvýšená produkce ROS a akumulace triglyceridů v cytoplasmě. Naproti tomu NaBt samotný snižoval celkový počet buněk, měnil parametry buněčného cyklu (blok v G0/G1 nebo G2/M fázi), zvyšoval % plovoucích buněk a indukoval apoptózu detekovanou počtem buněk se sníženým MMP, % buněk v subGo/G1 populaci, aktivací kaspáz, štěpením PARP a množstvím buněk s apoptickou morfologií jader. Kromě toho byla detekována zvýšená tvorba ROS, akumulace triglyceridů v cytoplazmě a narůstání fluorescence MC540, která je znakem strukturálních změn membránových lipidů ve smyslu vytváření volnější struktury (loosely packed lipids).
Po kombinovaném působení VNMK s NaBt bylo detekováno další významné zvýšení fluorescence MC540, akumulace triglyceridů, produkce ROS a další modulace parametrů buněčného cyklu. Účinky kombinace s DHA na některé parametry (zejména produkci ROS, akumulaci triglyceridů, či viabilitu) byly výraznější, nežli při kombinaci s AA. U buněk HCT116 byla indukce apoptózy byla kombinaci NaBt s VNMK redukována a zpožděna, což korelovalo s modulací exprese protiapoptického proteinu Mcl-1, aktivitou kaspázy-3 a štěpením poly(ADP-ribose) polymerázy. U těchto buněk byla navíc po působení NaBt detekována časově závislá zvýšená povrchová exprese translokázy mastných kyselin (FAT/CD36), která hraje úloha v transportu VNMK do buněk a mitochondrií. Tato exprese byla rovněž významně posílena při kombinovaném působení s AA nebo DHA.
Účinky studovaných látek se s ohledem na některé parametry lišily u buněk HCT116 a HT-29. Zatímco u buněk HT-29 (a některých dalších střevních linií, např. CaCo-2 a nenádorových fetálních buněk FHC) NaBt indukoval blok v G0/G1 fázi buněčného cyklu a diferenciaci, u buněk HCT-116 působil blok v G2/M fázi a diferenciační účinky se neprojevily. Diferenciace HCT-116 nebyla změněna ani kombinací s AA nebo DHA, kdežto u buněk HT-29 a FHC byla diferenciace po kombinovaném působení modulována.
Rozdíly v odpovědi na studované látky jsou dány pravděpodobně různým stupněm transformace těchto linií (normální FHC, dobře diferencované neinvazivní HT-29 a silně transformované invazivní HCT-116 buňky). Další vztahy a souvislosti jednotlivých parametrů a dějů jsou předmětem dalšího výzkumu.

Závěr
Z dosavadních výsledků lze uzavřít, že lipidové látky jako jsou VNMK a butyrát spolu mohou interagovat ve smyslu modulace buněčných lipidů, změn oxidativního metabolismu a dalších parametrů, které vyúsťují ve změny proliferace, diferenciace a apoptózy buněk kolonu. Charakter těchto změn je pravděpodobně závislý na stupni transformace buněk. I když je potřeba dále objasňovat konkrétní detailní mechanismy této interakce je jasné, že lipidové složky výživy mohou významně modulovat chování buněk střeva. Lze o nich tedy uvažovat i jako o farmakologicky působících látkách, kterými lze příznivě (či nepříznivě) ovlivnit řadu (pato)fyziologických procesů, případně i modifikovat účinky terapeutik. To má svůj význam jak ve smyslu hledání příčin některých patofyziologických stavů, tak s ohledem na využití poznatků pro nové protinádorové terapeutické přístupy.

Literatura

1. Johnson I.T. (2004), Mutat Res 551:9-28
   
2. Nkondjock A., et al. (2003), Cancer Detect Prevent 27:55-66
   
3. Gerber M., et al. (2005), Eur J Lipid Technol 107 (in press, online)
   
4. Simopoulos A.P. (2002), Biomed Pharmacother 56:365-379
   
5. Reddy B.S. (2004), Int J Cancer 112:1-7
   
6. Lee A.G. (2004), Biochim Biophys Acta 1666:62-87
   
7. Larsson S.C., et al. (2004), Am J Clin Nutr 79:935-945
   
8. Yeh Ch.S. (2005), Cancer Lett (in press, online)
   
9. Rudolph I.L. (2001), Nutr Res 21:381-393
   
10. Daly K., et al. (2005), Biochem Soc Transactions 33, part 4:733-735
    
11. Young G.P., et al. (2005), Mol Nutr Food Res 49:571-584
    
12. Hofmanová J., et al. (2005), Eur J Nutr 44:40-51
    
13. Hofmanová J., et al. (2005), Cancer Lett 218:33-41
    
14. Vaculová A., et al. (2005), Cancer Lett (in press, online)
    
15. Kovaříková M., et al., (2000), Eur J Cancer 36:1844-1852
    
16. Stilwell W., et al. (1993), Biochim Biophys Acta 1146:136-144
    
17. Healy D.A., et al. (2003), Clin Science 104:171-179

Práce byla podporována granty GAČR 524/04/0895 a IGA AVČR 1QS500040507