Interakce TNF-α s butyrátem během diferenciace a apoptózy střevních epiteliálních buněk

Epiteliální buňky tlustého střeva jsou ovlivňovány řadou látek různého původu – například trávícími enzymy a žlučovými kyselinami, dále některými látkami přecházejícími z krve (hormony apod.), nebo růstovými faktory produkovanými buňkami imunitního systému. Velké množství rozličných látek se do střeva dostává z potravy. Z hlediska ovlivnění střevních epiteliálních buněk je významné zastoupení tuků (především vysoce nenasycených mastných kyselin) a také množství nestravitelné vlákniny v přijímané potravě.
Všechny tyto látky mohou v tlustém střevě spolupůsobit a vzájemně se ovlivňovat, přičemž mohou mít na střevní epitel různý vliv. Mohou na jedné straně přispívat ke vzniku infekčních, zánětlivých nebo nádorových onemocnění střeva, na straně druhé mohou napomáhat při regeneraci postižené tkáně a při léčbě zmíněných chorob.^[1,2]
J ednou z látek ovlivňujících střevní epitel je kyselina máselná (butyrát), který vzniká v tlustém střevě bakteriální fermentací nestravitelné vlákniny přijímané potravou.^[3,4] Bylo prokázáno, že tato mastná kyselina s krátkým řetězcem má schopnost potlačovat proliferaci a naopak posilovat diferenciaci a indukovat apoptózu buněk střeva v koncentracích okolo 5 mM, a to jak in vitro tak in vivo.^[5] Tím přispívá k rovnováze cytokinetických procesů u epiteliálních buněk v kryptách tlustého střeva.
Nádory nekrotizující faktor alfa (TNF-α) je endogenně produkovaný cytokin, který patří mezi intenzivně studované biologicky aktivní látky. Hraje významnou úlohu v imunitních a zánětlivých reakcích, endotoxickém šoku, kachexii a v regulaci buněčného růstu a smrti.^[6] Ve střevě je produkován buňkami imunitního systému, zejména makrofágy, a ve tkáních postižených zánětem je jeho množství významně zvýšeno.^[7] V tkáních získaných z kolorektálních nádorů pacientů bylo nalezeno zvýšené množství endogenního TNF-α ve srovnání s odpovídajícími normálními kolorektálními tkáněmi.^[8]
V naší předchozí práci jsme na modelu lidské buněčné linie HT-29 odvozené od adenokarcinomu tlustého střeva prokázali, že mezi působením butyrátu (NaBt) a TNF-α existuje interakce^[9]. TNF-α potlačoval v našich experimentech vyvolané znaky diferenciace – konkrétně aktivitu alkalické fosfatázy a polymerizaci F-aktinu v buňkách. Na druhé straně jsme potvrdili i jeho schopnost zvyšovat při společném působení s NaBt množství buněk umírajících apoptózou.^[10] Tyto výsledky ukazují na možnou úlohu TNF-α při poškození epiteliálních buněk a vzniku či potenciaci neoplastických změn během dlouhotrvajících chronických zánětů tlustého střeva, vzhledem k jeho schopnosti ovlivňovat účinky NaBt na střevní epitel.
Naše dřívější poznatky o schopnosti TNF-α potlačovat diferenciaci a posilovat apoptózu HT-29 buněk navozenou NaBt jsme ověřovali i u buněk CaCo-2 odvozených od nádoru tlustého střeva a u nenádorových buněk FHC odvozených od lidského embryonálního epitelu střeva. Tyto nové výsledky silně korelují s poznatky získanými na buněčné linii HT-29. NaBt samotný potlačoval významně proliferaci, zastavoval buňky v G0/G1 fázi buněčného cyklu, navozoval buněčnou smrt a významně indukoval diferenciaci CaCo-2 i FHC buněk. Naproti tomu samotný TNF-α byl ve srovnání s působením NaBt poměrně neúčinný. Při kombinaci obou těchto látek nedošlo k dalšímu posílení antiproliferačního účinku NaBt, ale byla významně posílena indukce apoptózy (přibližně 8,5-násobně u CaCo-2 buněk a 6,5-násobně u FHC buněk; detekce barvením jader DAPI a fluorescenční mikroskopií). Dále TNF-α významně potlačoval NaBt-navozenou diferenciaci buněk (1,5-násobné snížení u CaCo-2 buněk a 5,5-násobné u buněk FHC; detekce aktivity vnitrobuněčné alkalické fosfatázy). Potvrdili jsme tak, že interakce TNF-α s NaBt ovlivňující diferenciaci a apoptózu střevních buněk má obecnější platnost. V dalších experimentech studujících mechanismy interakce TNFα s NaBt byly srovnávány nádorové buňky HT-29 a nenádorové fetální buňky FHC.
V přenosu signálů TNF-α je zapojena celá řada enzymů. Jedním z nich je fosfolipáza A2 (PLA2), která je u řady buněčných typů aktivována TNF-α a uvolňuje z membrán vysoce nenasycenou kyselinu arachidonovou (20:4, n-6; AA).^[11,12] Předpokládáme, že kyselina arachidonová a její oxidativní metabolity – eikosanoidy – by mohly být zapojeny i do přenosu signálů souvisejících s interakcí TNF-α a butyrátu u střevních buněk. Metabolizace kyseliny arachidonové může probíhat třemi cestami katalyzovanými cyklooxygenázami (COX), lipoxygenázami (LOX) nebo monooxygenázovou aktivitou cytochromu P-450.^[13] V tlustém střevě hrají významnou úlohu především cyklooxygenázové metabolity – prostaglandiny a tromboxany, jejichž koncentrace bývá ve srovnání se zdravou tkání zvýšena ve tkáních postižených zánětem^[14] nebo nádory^[15] díky vysoké aktivitě COX-2. V poslední době bylo u nádorů tlustého střeva zjištěno i zvýšené množství 12 – a 15-LOX,^[16] a během diferenciace střevních nádorových buněk NaBt zvýšená exprese 5 – a 12-LOX.^[17,18] Zapojení těchto metabolických cest do amechanismu interakce TNF–α a NaBt je možno studovat s využitím vhodných inhibitorů COX a LOX.
Sledovali jsme tedy, zda inhibiční zásahy do metabolismu AA mohou ovlivnit schopnost TNF-α potlačovat diferenciaci a posilovat apoptózu buněk HT-29 i FHC navozenou NaBt. Společně s TNF-α a NaBt byly aplikovány vybrané inhibitory metabolismu AA nebo specifický inhibitor PLA2. Pokud jde o proliferaci, nedocházelo u buněk HT-29 při spolupůsobení inhibitorů k žádným změnám. Avšak snížená proliferace buněk FHC po působení kombinace TNF-α a NaBt byla zpětně významně zvýšena inhibicí COX, LOX i PLA2. Schopnost TNF-α posilovat apoptózu navozenou NaBt byla po přidání inhibitorů jestě významněji zvýšena u buněk FHC, zatímco u buněk HT-29 nebyla inhibitory ovlivněna. Přidání inhibitorů nemělo u obou buněčných linií žádný vliv na potlačení NaBt navozené diferenciace působením TNF-α . Je tedy pravděpodobné, že metabolismus AA by mohl hrát určitou roli během interakce TNF-α a NaBt spíše u buněk nenádorových.
Exprese enzymu PLA2 byla u obou buněčných linií při kombinovaném apůsobení NaBt a TNF-α potlačena ve srovnání s působením samotného NaBt, který expresi tohoto enzymu indukoval pouze u buněk HT-29. Lze tedy předpokládat zapojení PLA2 do mechanismu interakce NaBt a TNF-α .
V buňkách dochází během zánětlivých procesů, hyperoxie, nebo působením UV-záření či některých specifických látek ke zvýšené produkci reaktivních kyslíkových radikálů (ROS), jako je superoxidový anion, peroxid a hydroxylový anion.^[19] Mezi biologické následky zvýšené koncentrace ROS v buňkách patří i změny v signálních dráhách a expresi genů, které souvisejí s buněčným růstem, diferenciací a apoptózou.^[20] Mezi látky, které navozují v buňkách změny oxidativního metabolismu patří i NaBt^[21] a TNF-α ^[22] a lze tedy předpokládat, že při jejich interakci se mohou uplatňovat i tyto mechanismy.
Změna oxidačně/redukčního stavu střevních buněk byla sledována pomocí detekce produkce ROS (průtoková cytometrie). Zatímco u buněk HT-29 nedocházelo k významným změnám v produkci ROS, buňky FHC produkovaly zvýšené množství po působení NaBt. TNF-α však tuto NaBt indukovanou produkci dále neovlivňoval. Metabolismus a ROS tedy pravděpodobně nehraje v mechanismu interakce NaBt s TNF-α žádnou roli.
TNF-α aktivuje v mnoha systémech transkripční faktor NF-_kB.^[23] Bylo prokázáno, že aktivace NF-_kB má u mnohých buněčných linií protiapoptické účinky.^[24] V diferencovaných částech střevních krypt, kde dochází k odumírání buněk apoptózou, byla nalezena zvýšená exprese proteinů rodiny I_kB, které interagují s NF-_kB a udržují ho v inaktivní formě.^[25]NaBt je schopen potlačovat kaktivitu transkripčního faktoru NF-_kB, a pro tuto vlastnost by mohl být využíván během terapií chronických zánětů střeva (např. Crohnovy choroby).^[26] Vzhledem k souvislosti aktivity NF-α B stavem střevní epiteliální tkáně předpokládáme, že exprese a aktivita tohoto transkripčního faktoru by mohla být u buněk tlustého střeva ovlivněna rovněž během interakce působení NaBt a TNF-α .
V našich experimentech se exprese NF-_kB proteinu lišila v závislosti na buněčném typu – u buněk HT-29 se neměnila, zatímco u FCH buněk docházelo k jejímu potlačení vlivem TNF-α a tento účinek se ještě zvyšoval při kombinovaném působení s NaBt. Vazebná aktivita NF-_kB byla u buněk HT-29 silně indukována TNF-α (41-násobně po 4 hodinách, 47-násobně po 8 hodinách a 75-násobně po 24 hodinách působení) a v menší míře také samotným NaBt po delší době působení (3-násobně po 24 hodinách). Při kombinovaném působení se aktivita NF-_kB vzhledem k efektu TNF-α nejprve dál zvýšila (4 hodiny), avšak po delší době působení (24 hodin) se zpětně snížila. Z těchto výsledků vyplývá, že aktivace NF-_kB bude velmi pravděpodobně hrát významnou úlohu v mechanismu interakce NaBt a TNF-α.
Dalšími významnými transkripčními faktory aktivovanými ligandem jsou receptory aktivované peroxizomovými proliferátory (PPAR). V současnosti je nejvíce studovanou formou těchto jaderných gfaktorů je PPAR-γ. Geny aktivované přes PPAR-γ jsou zapojeny do kontroly diferenciace buněk, apoptózy a regulace buněčného cyklu. U střevních buněk způsobuje aktivace PPAR-γ inhibici růstu a vyvolává jejich diferenciaci.^[27] Během diferenciace nádorových buněk tlustého střeva NaBt dochází ke zvyšování exprese PPAR-γ.^[28] Naším cílem bylo zjistit, zda účinek TNF-α na NaBt vyvolanou diferenciaci buněk zahrnuje i změny aktivity tohoto transkripčního faktoru.
Také PPAR-γ byl rozdílně exprimován u použitých buněčných modelů – u buněk HT-29 docházelo k mírnému nárůstu exprese po působení NaBt a kombinace obou faktorů, na druhou stranu stejné pokusné zásahy měly u buněk FHC opačný efekt. Vazebná aktivita PPAR-γ byla významně stimulována působením NaBt (1,6-násobně po 4 hodinách, 2-násobně po 8 hodinách a 2,8násobně po 24 hodinách působení). Tato NaBt navozená stimulace byla dále posílena vlivem TNF-α (1,5-násobně po 4 hodinách a 1,4-násobně po 8 hodinách kombinovaného působení), avšak po delší době působení (24 hodin) docházelo k jejímu opětnému snížení. PPAR-γ se tedy pravděpodobně také účastní interakce NaBt a TNF-α.
Závěrem lze říci, že jsme potvrdili v obecnější rovinně schopnost TNF-α modulovat účinky NaBt, a to nejen u nádorových buněk střeva, ale i u normálního střevního epitelu. Možné mechanismy této interakce byly pro pochopení rozdílů studovány na nádorové i normální buněčné linii střeva. Výsledky naznačují, že určitou roli by v mechanismu interakce NaBt s TNF-α mohla hrát PLA2 a metabolismus AA, a velmi pravděpodobné je zapojení traskripčních faktorů NF-_kB a PPAR-γ. Naopak metabolismus ROS zřejmě nehraje během studované interakce žádnou roli. Určité rozdíly ve výsledcích byly pozorovány mezi nádorovými a nenádorovými buňkami, což předesílá, že u nich budou zapojeny odlišné mechanismy. Dosažené výsledky přispívají k porozumění regulacím základních buněčných procesů a k poznání vzniku a rozvoje různých patologických stavů jako jsou zánět a neoplastické změny střeva. Mají rovněž význam pro preventivní a terapeutické přístupy uvažované u gastrointestinálních poruch a mohou být využity jak pro veterinární tak humánní medicínu.

Použitá literatura:

1. Lipkin M et al. Annual Review of Nutrition 19, 545-586 (1999).
   
2. Petronis A and Petriniene R. Gut 47, 302-306 (2000).0/li>
   
3. Clausen MR and Mortensen PB. Gut 37, 684-689 (1995).
   
4. Scheppach W et al. Eur J Cancer 31A, 1077-1080 (1995).
   
5. Pouillart PR. Life Sci 63, 1739-1760 (1998).
   
6. Larric JW and Wright SC. FASEB J 4, 3215-3223 (1990).
   
7. Plevy SE et al. J Immunol 150, 10A (1993).
   
8. Numata A et al. Cancer 68, 1937-1943 (1991).
   
9. Kovaříková M et al. Eur J Cancer 36, 1844-1852 (2000).
   
10. Giardina C et al. Biochim Biophys Acta 1448, 425-438 (1999).
    
11. Prezioso JA et al. Cytokine 7, 517-525 (August 1995).
    
12. MacEwan DJ. FEBS Letters 379, 77-81 (1996).
    
13. Shimizu T and Wolfe LS. J Neurochemi 55, 1-15 (1990).
    
14. Krause W and DuBois RN. Prostaglandins Lipid Mediators 61, 145-161 (2000).
15. Rigas B et al. J. Lab. Clin. Med. 122, 518-523 (1993).
    
16. Ikawa H et al. Cancer Res. 59, 360-366 (1999).
    
17. Wachtershauser A et al. Biochem Biophys Res Commun 268, 778-783 (2000).
    
18. Kamitani H et al. Archives Biochem Biophys 368, 45-55 (1999).
    
19. Cerutti PA and Trump BF. Cancer Cells 3, 1-7. (1991).
    
20. Dalton TP et al. Annu Rev Pharmacol Toxicol 39, 67-101 (1999).
    
21. Giardina C and Inan MS. Biochim Biophys Acta 1401, 277-288. (1998).
    
22. Cossarizza A et al. Experim Cell Res 220, 232-240 (1995).
    
23. Wallach D et al. Annual Review Immunol 17, 331-367 (1999).
    
24. Beg A and Baltimore D. Science 274, 782-793 (1996).
    
25. Wu GD et al. J Leukocyte Biol 66, 1049-1056 (1999).
    
26. Segain JP et al. Gut 47, 397-403 (2000).
    
27. Kitamura S et al. Jpn J Cancer Res 90, 75-80 (1999).
    
28. Wachtershauser A et al. Biochem Biophys Res Commun 272, 380-385. (2000).