Interakce metalothioneinu s těžkými kovy a protinádorovými léčivy založených na bázi platiny

Klíčová slova
metalothioneiny, analýza, elektrochemie, rtuťová elektroda, interakce, těžké kovy, protinádorová léčiva, diferenční pulzní voltametrie

1. Úvod
Významným proteinem vázajícím kovy je metalothionein. V novějších výzkumech se posuzuje vztah nadměrné exprese MT a koncentrace protinádorových léčiv obsahujících ve své molekule kov. Protinádorový efekt cis-platiny je dán jeho vazbou do DNA, čímž dochází k zabránění replikace DNA. Předpokládá se, že cisplatina může pravděpodobně stimulovat transkripci MT genu. Exprimovaný MT začne vyvazovat cis-platinu přítomnou v buňkách. Terapeutické řešení je při současných technologiích obtížné. Je možné omezit množství vzniklého MT za využití genové terapie, degradace proteinu, případně zvýšenou koncentrací externě dodaného těžkého kovu. Z těchto důvodů je velmi potřebné studovat interakce MT s těžkými kovy a protinádorovými léčivy za pomoci snadných a spolehlivých instrumentálních technik.

2. Materiály a metody
Chemikálie
MT z králičích jater (MW 7143), obsahující 5,9 % Cd a 0,5 % Zn, byl zakoupen u firmy Sigma Aldrich (St. Louis, USA). Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) byl vyroben Molecular Probes (Evgen, Oregon, USA). Chlorid sodný a ostatní soli byly získány v čistotě ACS od společnosti Sigma Aldrich. Zásobní roztok standardu MT 10 µg.ml–1 byl připraven za využití ACS vody (Sigma-Aldrich, USA) a uložen ve tmě při –20 °C. Pracovní standardní roztoky byly vždy připravovány denně a to naředěním ze zásobního roztoku.

Elektrochemické stanovení
Elektrochemické stanovení bylo provedeno pomocí přístroje AUTOLAB analyzátor (EcoChemie, Netherlands), který byl napojený na VA-Stand 663 (Metrohm, Switzerland), používala se pracovní cela s tříelektrodovým systémem. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm². Referentní elektroda byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocná elektroda byla uhlíková tyčinka. Základní elektrolyt byl 0,5 M NaCl, pH 6,4, kyslík byl odstraněn bubláním argonem pro dobu 120 s. DPV parametry: počáteční potenciál -1,2 V, koneč ný potenciál -0,3 V, modulační čas 0,057 s, step potenciál 1,05 mV/s a modulační amplituda 25 mV.

3. Výsledky a diskuse
MT (1 µM) byl akumulován na povrch pracovní elektrody a získaná voltametrická křivka je ukázána na obr. 1. Byly pozorovány všechny předpokládané elektrochemické signály MT [MT(Cd); MT(Zn); CdT`; ZnT`; CdT a ZnT)]. Již dříve jsme zjistili, že MT je na povrch HMDE velmi dobře akumulovatelný. Získaná závislost na době akumulace měla tvar Langmuierovské izotermy. Dokonalé pokrytí elektrodového povrchu bylo dosaženo po expozici 100 až 150 s. Koncentrační závislost byla studována metodou postupného ředění vzorku MT. Ze všech signálů přítomných na základním voltamogramu jsme pro vyhodnocení koncentrační závislosti zvolili pík CdT (-0,64 V). Ve vyšších koncentracích dochází pravděpodobně k plnému pokrytí povrchu pracovní elektrody, čímž se mění vlastnosti elektrodové dvojvrstvy. V případě nižších koncentrací (50 nM až 1 µM MT) jsme získali lineární závislost koncentrace MT na proudové odezvě signálu CdT (y = 21,37x – 0,0575; R² = 0,9983) s limitem detekce MT
(3S/N) 40 nM.

Elektrochemické chování metalothioneinem modifikované HMDE v přítomnosti Cd(II) a Zn(II)
MT (10 µM) byl na povrch HMDE adsorbován 120 s a následně byla modifikovaná elektroda vystavena Cd(II) a nebo Zn(II) o mkoncentraci 100 anebo 10 µM po dobu 60 s. Poté byla elektroda omyta (0,5 NaCl) a umístěna do měřící nádobky. V případě Cd(II) byly na získané voltametrické křivce pozorovány čtyři signály pravděpodobných komplexů MT a Cd(II), a to CdT`, CdT, MT(Zn) a MT(Cd). Zatímco se po přídavku Zn(II) objevily na voltamogramu signály CdT, MT(Zn) a ZnT. Zajímalo nás, jak ovlivní vzniklé signály měnící se doba akumulace těžkého kovu na MT modifikovaný povrch HMDE při jeho konstantní koncentraci. Signály MT(Cd) a CdT’ se zvyšovaly a signál CdT se snižoval s rostoucí dobou akumulace těžkého kovu. Pík MT(Zn) se téměř neměnil. Ze získaných výsledků jsme pro stanovení obou kovů zvolili dobu akumulace 300 s, protože zajišťuje dostatečně velké proudové odezvy sledovaných signálů a zároveň relativně rychlý průběh stanovení. Dalším sledovaným parametrem byl vliv koncentrace obou kovů na pozorované signály. Se vzrůstající koncentrací Cd(II) docházelo k lineárnímu nárůstu signálu CdT` a MT(Cd). Pík CdT se vzrůstající koncentrací exponenciálně klesal (Cd: y = 39,165e–0,0046x, R² = 0,9733). Předpokládáme, že za signál CdT je pravděpodobně odpovědná sloučenina proteinu nebo peptidu se rtutí (SH-protein + Hg = HgS-protein). Do SH clusterů se váže kov a tím brání SH skupinám v interakci s povrchem pracovní Hg elektrody. Proto je možné pozorovat změny v tomto signálu. Signál CdT se zvyšující koncentrací Zn(II) klesá (Zn: y = 11,235e–^0,0047x, R² = 0,9565) a signály MT(Zn) a ZnT se vzrůstající koncentrací Zn(II) rostly. Ze získaných výsledků vyplývá, že pozorované jevy tedy skutečně souvisí s mnohem složitějším chováním MT na povrchu pracovní elektrody a signál CdT je spíše signálem SH skupin proteinu než redukcí Cd případně sloučeniny Cd s Hg.

Vliv času interakce těžkých kovů s modifikovanou HMDE
Na povrch HMDE byl adsorbován MT v koncentraci 10 µM a po jeho 60 ms interakci s HMDE byla sledována závislost s 10 µM Cd(II). Zjistili jsme, že v průběhu interakce dochází k postupnému snižování signálu CdT průměrně asi o 6 % na každých 60 s expozici těžkým kovem a po 420 s je signál CdT snížen o více jako 50 %. Signál MT(Zn) se v průběhu experimentu měnil průměrně o 3 %. Již na počátku experimentu byl pozorovatelný signál, MT(Cd), který vzrůstající dobou expozice modifikované HMDE vzrůstal. Nejdříve však velmi pozvolně, a teprve od 250 s byl pozorován výrazný nárůst signálu MT(Cd). Negativněji od píku CdT byl pozorován další rychle rostoucí signál CdT` teprve od času akumulace asi 180 s.

Stanovení Cd(II) and Zn(II) pomocí modifikované HMDE v biologické matrici
Dále byly koncentrace Cd(II) a Zn(II) stanoveny ve složité biologické matrici. Pro tento účel jsme zvolili lidskou moč, která byla před použitím nejdříve 10x naředěna. Do takto připravené matrice bylo přidáno Cd(II) a nebo Zn(II) ve mstupňovaných koncentracích (0, 1, 5, 10, 25, 50 a 100 µM). Pozorované odezvy signálů (recovery) se pohybovaly v rozmezí 90-105 % ve srovnání s měřením bez biologické matrice. Získané závislosti byly na zvyšující se koncentraci Cd(II) anebo Zn(II) lineární.

Využití modifikované HMDE pro studium protirakovinového léčiva obsahujícího Pt
Námi navržený postup pro studium interakce MT s těžkými kovy byl využit pro stanovení koncentrace protirakovinového léčiva cis-platiny [Pt^II (NH3)2Cl2]0; Mw 303. Na obrázku 2 je ukázán voltamogram cis-platiny po jeho interakci s MT modifikovanou HMDE. Na záznamu se objevuje signál při potenciálu -1,1 V, který pravděpodobně odpovídá vzniklému komplexu cisplatiny s MT. Byla studována závislost na na době interakce cis-platiny s modifikovanou HMDE. Získaná závislost PtMT komplexu s rostoucí dobou interakce rostla. Závislost na koncentraci byla v mtestovaném rozsahu (1mM – 100 µM) lineární.



4. Závěr
Vývoj snadno a rychle obnovitelných senzorů pro detekci rozdílných analytů je významným úkolem současné analytické chemie a biochemie. Byl navržen jednoduchý senzor pro stanovení Cd(II), Zn(II) a cis-platiny využívající modifikace povrchu rtuťové kapkové elektrody s metalothioneinem.

Literatura

1. Palmiter, R.D. (1994) Regulation of metallothionein gense by heavy metals appears to be mediated by a zinc-sensitive inhibitor that interacts with a constitutively active transcription fakctor, MTF-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 1219–1223.
   
2. Kaegi, J.H.R. and Schaffer, A. (1988) Biochemistry of Metallothionein. Biochemistry 27, 8509–8515.
   
3. Zelená, J., Potešil, D., Vacek, J., Adam, V., Hradecký, J., Prusa, R., Kizek, R. and Vojtěšek, B. (2004) Metalothionein jako prognostický marker nádorového onemocnění. Klinická onkologie 17, 190-195.
   
4. Kizek, R., Vacek, J., Adam, V. and Vojtěšek, B. (2004) Vztah metalothioneinu k rakovině a protinádorové léčbě. Klin. Biochem. Metab. 12, 72-78.
   
5. Dabrio, M., Rodríguez, A.R., Bordin, G., Bebianno, M.J., De Ley, M., Šestáková, I., Vašák, M. and Nordberg, M. (2002) Recent developments in quantification methods for metallothionein. J. Inorg. Biochem. 88, 123–134.
   
6. Dabrio, M. and Rodríguez, A.R. (2000) Electrochemical study of human foetal liver metallothionein: influence of the additions of cadmium and zinc. Anal. Chim. Acta. 406, 171–181.
   
7. Díaz-Cruz, M.S., Mendieta, J., Tauler, R. and Esteban, M. (1997) Cadmium-binding properties of glutathione: a chemometrical analysis of voltammetric data. J. Inorg. Biochem. 66, 29–36.
   
8. Díaz-Cruz, M.S., Mendieta, J., Monjonell, A., Tauler, R. and Esteban, M. (1998) Study of the zinc-binding properties of glutathione by differential pulse polarography and multivariate curve resolution. J. Inorg. Biochem. 70, 91–98.
   
9. Díaz-Cruz, M.S., Mendieta, J., Tauler, R. and Esteban, M. (1999) Multivariate curve resolution of cyclic voltammetric data:
   application to the study of the cadmium-binding properties of glutathione. Anal. Chem. 71, 4629–4636.
   
10. Díaz-Cruz, M.S., Díaz-Cruz, J.M., Mendieta, J., Tauler, R. and Esteban, M. (2000) Softand hard-modeling approaches for the determination of stability constants of metal-peptide systems by voltammetry. Anal. Biochem. 279, 189–201.
    
11. Díaz-Cruz, M.S., Esteban, M. and Rodríguez, A.R. (2001) Square wave voltammetry data analysis by multivariate curve resolution: application to the mixed-metal system. Anal. Chim. Acta. 428, 285–299.
    
12. Díaz-Cruz, M.S., Mendieta, J. and Esteban, M. (2002) Combined use of differential pulse plarography and multivariate curve resolution: as applied to the study of metal mixed comples of the metallohionein related hexapeptide Lys-Cys-Thr-CysCys-Ala. Electroanalysis 14, 50–56.
    
13. Trnkova, L., Kizek, R. and Vacek, J. (2002) Catalytic signal of rabbit liver metallothionein on a mercury electrode: a combination of derivative chronopotentiometry with adsorptive transfer stripping. Bioelectrochemistry 56, 57-61.
    
14. Kizek, R., Trnkova, L. and Palecek, E. (2001) Determination of metallothionein at the femtomole level by constant current stripping chronopotentiometry. Anal. Chem. 73, 4801-4807.
    
15. Strouhal, M., Kizek, R., Vacek, J., Trnková, L. and Němec, M. (2003) Electrochemical study of heavy metals and metallothionein in yeast Yarrowia lipolytica. Bioelectrochemistry 60, 29–36.
    
16. Dolezel, P. and Kuban, V. (2002) Mass spectrometric study of platinum complexes based on cisplatin. Chem Pap-Chem. Zvesti 56, 236-240.

Příspěvek vznikl za podpory grantů RASO 2005, FRVŠ 2348/F4a a GAČR 525/04/P132