IFN-gama ovlivňuje expresní a funkční změny vybraných členů signální dráhy JAK/STAT – srovnání normálního a maligního epitelu mléčné žlázy

Úvod: Správný průběh proliferace a diferenciace epitelu mléčné žlázy je mimo jiné zajišťován aktivitou signálních proteinů multigenové rodiny STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) a zpětnovazebných negativních regulátorů rodiny SOCS (Supresor of Cytokine Signalig). Expresní nebo funkční změny těchto signálních molekul jsou poměrně často nalézány u celé řady lidských malignit včetně rakoviny prsu. Právě karcinom mléčné žlázy se jeví jako vhodný model pro bližší objasnění aberantního přenosu signálu, který může hrát určitou roli v pozměněné vnímavosti buněk na externí stimulaci a v procesu vzniku a vývoje nádorové buňky.
Cíl: Práce byla zaměřena na studium účinku interferonu gama (IFN-γ) na expresi vybraných členů rodiny STAT a SOCS a na funkční modifikace (fosforylační změny) proteinů STAT1/3 u normálních a maligních buněk mléčné žlázy.
Materiál a metody: Použili jsme osm dobře definovaných lidských buněčných linií karcinomu mléčné žlázy a primokulturu normálního mamárního epitelu získaného z redukční mamoplastiky. U materiálu byla ověřena přítomnost estrogenových (ER) a progesteronových (PR) receptorů. Fosforylace proteinů STAT1/3 na konzervovaných aminokyselinových zbytcích S727-STAT1,Y701-STAT1, S727-STAT3, Y705-STAT3 byla stanovena metodou Western blotu. Expresní profily STAT/SOCS na úrovni mRNA byly analyzovány pomocí RT-PCR u normálného epitelu a dvou vybraných buněčných linií (MCF-7 a MDA-MB-231).
Výsledky: Western blot analýza proteinů STAT1/3 u osmi stabilizovaných linií karcinomu mléčné žlázy a normálních buněk ukázala, že inkubace s IFN-γ nevedla ke kvantitativním změnám těchto proteinů. U normálních buněk došlo po přídavku IFN k indukci fosforylace proteinu STAT3 na tyrozinovém zbytku (Y705), zatímco u maligních protějšků nikoliv. Fosforylace STAT1 na tyrozinu (Y701) po působení IFN-γ stoupala jak u normálních, tak i u maligních buněk. Fosforylace na konzervovaných serinových zbytcích STAT1/3 byla konstantní. Nenalezli jsme žádný vztah mezi fosforylačními a kvantitativními změnami STAT1/3 a přítomností ER/PR. RT-PCR analýza vybraných zástupců rodiny SOCS ukázala, že se normální mamární epitel a stabilizované buněčné linie karcinomu mléčné žlázy (MCF-7 a MDA-MB-231) navzájem lišily ve výši bazální hladiny transkriptů SOCS2 a SOCS3. Linie MDA-MB-231 obsahovala v porovnání s normálními buňkami a linií MCF-7 relativně vysoké množství SOCS3 mRNA, což naznačuje, že se může jednat o konstitutivní expresi. SOCS2 byl exprimován silně u linie MCF-7 na rozdíl od velmi slabého signálu u ostatních dvou kultur. Ani u jedné analyzované kultury jsme nezískali PCR produkt odpovídající SOCS1. IFN-γ silně indukoval expresi SOCS3 v normálních buňkách v porovnání se slabou (MDA-MB-231) nebo zcela chybějící (MCF-7) indukcí u stabilizovaných buněčných linií. Expresní profily všech dosud známých STATů byly srovnatelné a po přídavku IFN-γ se neměnily.
Závěr: Z výsledků naší studie vyplývá, že maligní fenotyp mamárních buněk je spojen s represí fosforylace proteinu STAT3 na konzervovaném tyrozinovém zbytku po aplikaci IFN-γ. Zda se nádorové buňky liší od normálních buď na úrovni bazální transkripce některých negativních regulátorů rodiny SOCS nebo mírou indukce exprese SOCS3 po inkubaci s IFN-γ blíže objasní RT-PCR analýza většího počtu linií.
Práce byla finančně podporována granty GA ČR 301/06/0912, IGA MZ ČR NR/8341-3, AV ČR KJB502070601 a VZ MZO 00209805.