Identifikace profilu genové exprese nádoru pomocí DNA čipů a jeho využití v diagnostické a prediktivní onkologii

Úvod
Aberantní genová exprese je klíčovým krokem iniciace, promoce a progrese tumoru. Vzniká na podkladě chromozomálních změn, mnohočetných genových mutací a genetické nestability nádorové buňky. Studium těchto změn za použití tradičních metod molekulární biologie je v širším měřítku velmi obtížné a ve druhé polovině minulého století bylo omezeno především na detekci produktů chromozomálních translokací (např. Bcr/abl), identifikaci základních genových mutací (např. p53, BRCA1), nebo kvantifikaci exprese jednotlivých genů. Porozumění pro většinu nádorů tak bylo omezeno především na jejich histologickou klasifikaci, grading, klinický rozsah a ojedinělé molekulární markery. Kombinace těchto kritérií byla a je více či méně úspěšně používána k rozlišení prognosticky odlišných skupin. Z pohledu 21. století charakterizovaného rozvojem nových technologií a existencí částečně i kompletně zmapovaných genomů již několika organismů, včetně lidského genomu, se to jeví jako nedostatečné. Je-li aberantní genová exprese skuteč ně klíč ovým krokem tumorogeneze a platí-li základní dogma informačního toku v biologických systémech (DNA>RNA>protein>fenotyp), vzniká tak předpoklad, že biologické koreláty genové exprese jsou identifikovatelné. Naděje je proto vkládána do DNA čipů (DNA microarrays), které představují zařízení schopné ve velmi krátkém čase paralelně detekovat a kvantifikovat expresi až desítky tisíc genů (profil genové exprese) a nebo identifikovat variabilitu genetického kódu. DNA čipové analýzy nám umožňují globální pohled na genovou expresi nádoru a identifikaci genetických markerů důležitých pro diagnostiku, klasifikaci a predikci nádorového onemocnění.

Základy technologie DNA čipů
DNA čipy můžeme definovat jako miniaturizované zařízení nesoucí na svém povrchu imobilizované fragmenty nukleových kyselin (sondy) v přesně určeném uspořádání. Tyto sondy jsou sekvenčně derivovány tak, aby mohly specificky hybridizovat s testovaným genetickým materiálem, který je předem speciálně označen za účelem posthybridizační detekce [3].
Existují dvě základní platformy DNA čipů, které se od sebe liší charakterem sond. V případě cDNA (complementary DNA) čipů jsou sondy dvouvláknové DNA o délce přibližně 300 – 4000 bp (párů bází). získávány z cDNA knihoven organismů. Druhým typem jsou oDNA – (oligonukleotidové) čipy, jejichž sondy jsou tvořeny jednovláknovou DNA o délce 20 – 100 bází. Nejvýznamnější předností oDNA čipů je možnost navrhnout sekvenci sond tak, aby byly schopny rozlišit i vysoce homologní sekvence příbuzných genů, včetně štěpných variant mRNA jednoho genu [4,5].
Podle způsobu výroby se produkce DNA čipů označuje „off-line“ nebo „in-situ“. V prvním případě je čipovacím přístrojem
(spotter, čipovač) přenášeno určité množství (0.25 – 5 nl) již předem vyrobené sondy (např. PCR reakcí z cDNA knihovny) z jejího zásobníku na povrch DNA čipu. Tak vzniknou hybridizační jednotky (HJ) o průměru 75-350 µm a vzájemné vzdálenosti 150-250 µm. Jedna HJ obsahuje až milión kopií molekul jedné sondy. HJ může být na čip nanesena v několika replikách. Druhý způsob, „in-situ“, slouží výhradně k produkci oDNA čipů. Syntéza oligonukleotidových sond z jednotlivých nukleotidů se fotolitograficky, nebo ink-jet technologií, uskutečň uje přímo na povrchu čipů. K identifikaci jednoho genu dostačuje u cDNA čipu jedna HJ, oDNA používají několik různých oligonukleotidových sond, a tedy i HJ (viz. obr.č.1., oDNA čip společnosti Affymetrix nesoucí na svém povrchu sondy pro 33000 lidských genů) [5].

Příprava a značení testovaného materiálu
Charakter analyzovaného materiálu se liší podle účelu použití čipu. Stanovujeme-li profil genové exprese tumoru, musíme z testovaného vzorku izolovat celkovou RNA nebo mRNA (cca 1-2% celkové RNA), a to v dostatečné kvalitě a množství. Za ideální je považováno 20 (10-100) µg celkové RNA nebo alespoň 5 µg mRNA. 100 µg celkové RNA lze vyizolovat z buněk tkáně o hmotnosti přibližně 100 mg (objem 100 mm³). Pracujeme-li s čipy určenými k resekvenování (detekce mutací: SNP apod.), izolujeme genomovou DNA.
Je-li testovaný materiál buněčně heterogenní (např. bioptický vzorek, obsahující nádorové buňky, leukocyty, buňky podpůrných tkání, apod.) a cílem je analyzovat pouze jednu jeho složku, použijeme k izolaci žádaných buněk laserovou mikrodisekci (laser capture microdissection – LCM). Pokud LCM nelze před izolací RNA provést, nabízí se možnost aplikovat „virtuální dissekci“ (viz. dále). V současnosti existují postupy k získání potřebného množství kvalitní RNA i z jediné buňky [6,7].
Izolovanou RNA je zapotřebí přepsat reverzní transkripcí do ideálně hybridizovatelné a fluorescenčně značené jednovláknové l-ss-cDNA (labeled, single strand complementary DNA). Nejčastěji se RNA značí přímou metodou, ve které jsou v reverzní transkripci inkorporovány do cDNA nukleotidy nesoucí molekulu fluorochromu (např. florochrom Cy3-„zelený“ nebo Cy5-„červený“, které se liší ve vlnové délce emitovaného záření). Používáme-li DNA, značí se podobným principem při PCR amplifikaci. Získaná l-ss-cDNA je následně hybridizována se sondami na povrchu DNA čipu.

U většiny čipů hybridizujeme na jednom čipu l-ss-cDNA získanou z testovaného a z referenčního vzorku (komerčně dodávaný nebo vlastní produkce) v poměru 1:1. Právě proto je nutné každou cDNA označit jiným flurochromem. Typicky je referenční l-ss-cDNA značena Cy3 a testovaná Cy5. U některých oDNA čipů se pro každý vzorek používá samostatný čip, a tedy i jeden fluorochrom. Po hybridizaci se zbylý materiál vymyje z povrhu čipu, jednotlivé hybridizační jednotky se excitují světlem o patřičné vlnové délce a emitované záření vycházející z molekul fluorochromů l-ss-cDNA molekul se detekuje pomocí snímacího zařízení pracujícího na principu fotonásobiče nebo CCD kamery [6,9]. Výsledek exprese daného genu je vyhodnocen číselně, jako absolutní hodnota naměřené fluorescence, nebo jako hodnota logaritmu poměru mezi hodnotou emise záření vycházejícího z testované (Cy5-červeně značené) a referenční (Cy3-zeleně značené) l-ds-cDNA hybridizované na jedné hybridizační jednotce reprezentující 1 gen. Takto získané hodnoty lze vyjádřit v pseudobarevném značení [8]. Viz. dále.

Základy biostatistického zpracování a interpretace DNA čipových dat
Z biostatistického pohledu slouží DNA čipy k analýze variability. Biologickou variabilitu reprezentuje:
a) různorodé zastoupení buněk ve vzorku (nádorové, fyziologické),
b) genetická heterogenita ve vzorcích tumorů způsobená selekcí a genomickou nestabilitou,
c) očekávané změny v souvislosti s laboratorními nebo klinickými podmínkami.

Kromě biologické variability existuje i neméně významná technická variabilita, která je způsobena:
a) odlišným zpracováním vzorků tumorů,
b) rozdílnostmi ve značení a hybridizaci cDNA,
c) nespecifickou cross-hybridizací sond DNA čipu,
d) technickou odlišností mezi jednotlivými DNA čipy.

Biostatistické analýzy si kladou za cíl odlišit biologickou variabilitu, která charakterizuje studovaný systém, od technické variability, která vzniká při zpracování vzorku a DNA čipu. Používají k tomu metody normalizace a specifické biostatistické metody. V případě biologické variability je důležité vyselektovat pouze změny, které odpovídají kladeným otázkám, a potlačit biologické reakce probíhající „na pozadí“ (např. stresová reakce buňky). Biostatistickými nástroji lze rovněž provést „virtuální dissekci“ tkáně pomocí buněčně specifických genů v případech, kde nebyla provedena izolace studované populace buněk před zpracováním RNA (např. odstranit z analýzy nádorových buněk profil exprese odpovídající T-lymfocytům apod.).
Biostatistické analýzy lze rozdělit na jednorozměrné a vícerozměrné (multidimenzionální). První skupinu tvoří metody poměrové, některé parametrické a neparametrické testy, permutační testy. Multidimenzionální skupinu představují metody založené na analýze vektorových a distančních parametrů genové exprese (každý gen je reprezentován vektorem, jehož souřadnicemi jsou hodnoty exprese genu v jednotlivém experimentu. Mezi jednotlivými vektory jsou vypočítány matematické vzdálenosti, které umožň ují soustředit tyto vektory do skupin na podkladě podobnosti mezivektorové vzdálenosti). Do této skupiny patří. metody: Hiearchical clustering, K-means clustering, Self organizing map, Principal Component Analysis, Vector machine learning, Relevance Networks. Další používané dělení biostatistických analýz zohledň uje fakt, zda se analýza uskutečň uje „s“, nebo „bez“ vědomí bližší informace o povaze analyzovaného vzorku (např. který vzorek reprezentuje nádorovou tkáň , který fyziologický protějšek). Není-li bližší informace do systému vložena, jedná se o „unsupervised (nekontrolovanou)“ analýzu. V opačném případě jde o „supervised (kontrolovanou)“ analýzu [10,11].
Nejpoužívanější formou prezentace výsledků DNA čipových analýz jsou dendrogramy, které tvoří dvoudimenzionální obrazce složené z barevných políček uskupených do pravidelně uspořádaných řádků a sloupců. Jeden řádek reprezentuje jeden konkrétní gen, jeden sloupec reprezentuje jeden konkrétní vzorek. Barva políčka odpovídá pseudobarevnému vyjádření exprese konkrétního genu v daném vzorku. Jednotlivé řádky a sloupce jsou v dendrogramu seskupeny a pospojovány svorkami na základě vzájemné podobnosti. Uvádíme příklad vlastního experimentu, ve kterém byly B-lymfoblastické linie NALM-6 a REH vystaveny apoptotickému stimulu. Na obrázku jsou ve sloupcích jednotlivé vzorky buněčných linií lišící se intenzitou stimulu, v řádcích patřičné geny. Červená barva v konkrétním políčku značí, že daný gen je u příslušného vzorku zvýšeně exprimován. Nadměrnost zelené barvy odpovídá převaze RNA z referenčního vzorku, a tedy snížené expresi daného genu v testovaném vzorku. Černá barva značí ekvivalentní expresi. Šedá barva znamená, že daná hybridizační jednotka byla vyřazena z analýzy (např. pro nekvalitní hybridizaci). /Barvy platí v případě barevného tisku/. Relativní srovnávací měřítko je pod obrázkem. Svorky v podobě dendrogramu nad obrazkem a vlevo hierarchicky zobrazují podobnost jednotlivých vzorků či genů. Na pravé straně obrazku nacházíme ontologické označení genů. Z obrazku vyplývá, že NALM-6 i REH buněčné linie reagovaly rozdílně na apoptotické stimuly. V rámci pozorování jedné buněčné linie byly reakce podobné. Analýza vyselektovala geny v jejichž odpovědi se obě buněčné linie lišily [32].
Praktická implementace výsledků DNA čipových analýz je spjata s četnými riziky, neboť neexistují závazná pravidla standardizace těchto experimentů. Většina publikovaných prací byla provedena s cDNA čipy vlastní výroby, jejichž kvalita je velmi rozdílná. Neexistují rovněž standardy zpracování miliónů datových položek z DNA čipových analýz, včetně jejich normalizace a formátu. Za tímto účelem byla přitom vyvinuta řada nových biostatitstických metod, jejichž validace je samostatným problémem a nebyla dosud rovněž vyřešena. Biostatistické zpracování dat je přitom zásadní částí experimentu a jeho interpretace. Teprve v posledních letech je ze strany vědecké komunity vyvíjena snaha k zavedení standardizace experimentů, jejich biostatistického zpracování a ontologie. Tak vznikl předpoklad k rozvoji veřejných databází shromaždujících výsledky DNA čipových analýz provedených v souladu s vytvořenými standardy. Vznikla Microarray Gene Expression Data Society (MGED), v roce 2001 byl publikován tzv. „MIAME“ protokol (Minimum Information About Microarray Experiment), v roce 2002 byl vytvořen standardizovaný datový formát (MAGE-ML) [13].

Využití profilu genové exprese nádoru v diagnostické a prediktivní onkologii
V roce 1999 byly publikovány první práce zabývající se molekulární klasifikací tumorů pomocí DNA čipů. Zpočátku se jejich autoři orientovali na identifikaci stávajících jednotek tumorů, později se odhodlali na podkladě vzešlých dat definovat nové klasifikační podjednotky.
T. R. Golub a E. S. Lander publikovali ve Science průlomovou vědeckou práci, ve které pomocí DNA čipové analýzy genové exprese dokázali odlišit pacienty s akutní myeloidní a akutní T– a B– lymfoblastickou leukémií. Podali zřetelný návod k tomu, jakým způsobem „učit“ DNA čipy správně identifikovat a zařadit stávající nosologické jednotky. Za tímto účelem shromáždili skupinu precizně diagnostikovaných vzorků sledovaných diagnóz, kterou rozdělili na dvě části, zkušební a testovací. Nejprve byla pomocí oDNA čipů nesoucích sondy pro 6817 lidských genů kontrolovaně analyzována první skupina čítající 38 zkušebních vzorků. Bylo identifikováno přibližně 1100 genů, jejichž exprese se u vybraných leukémií vzájemně lišila. Z těchto genů byla dalšími biostatistickými metodami vyselektována skupina 50 genů – prediktorů, které nejsilněji korelovaly se schopností vzájemně odlišit studované leukemické podjednotky (class predictors). Exprese těchto 50 genů byla následně detekována ve vzorcích testovací skupiny. Správnost predikce testovaných vzorků do jednotlivých diagnóz (AML vs T– a B–ALL) byla 100% [15]. Na tuto práci navázala řada dalších autorů. Armstrong et al., odlišil skupinu AML s abnormalitou MLL genu. Yeoh et al., dokázal s 96% přesností rozčlenit vzorky dětských ALL do šesti podskupin (early pre-B, pre-B, …) a pomocí skupiny 20 genů – prediktorů identifikoval s přesností 100% ty pacienty s ALL, u kterých sekundárně vznikla AML. Virtaneva et al., identifikoval skupinu AML nesoucích trisomii chromosomu 8, Schoch et al., byl schopen rozlišit AML s translokacemi: t(8;21), inv(16), t(15;17), které vedou ke vzniku fúzních genů AML1-ETO, CBFB-MYH11 a PML-RARA [16,17,18,19].
Z hlediska B-lymfoproliferací je dosud nejcennější práce kolektivu A.Alizadeh publikovaná v Nature. Autoři v ní nejenom dokázali, že DNA čipy jsou schopny jednotlivé choroby od sebe odlišit, ale navíc identifikovali dosud nepoznané podskupiny a otevřeli DNA čipům nové pole působnosti v oblasti prediktivní onkologie. Původně si kladli za cíl zjistit, zda jsou DNA čipy schopny na základě profilu genové exprese odlišit od sebe jednotlivé typy maligních B-lymfoproliferací a zda existují podobnosti mezi zjištěnými profily a profily genové exprese fyziologických B-lymfocytů různého vývojového stádia. Tým sestavil cDNA čipy nesoucí na svém povrchu sondy pro 17.856 cDNA. Protože většina sond (12.069) pocházela z cDNA knihoven B-lymfocytů, dostal čip označení „lymfočip“. Tým A.Alizadeh zanalyzoval pomocí lymfočipů 96 vzorků různých maligních B-lymfoproliferací a fyziologických B-lymfocytů odlišného stupně maturace (DLBCL, B-lymfocyty germinálního centra, aktivované a klidové B-lymfocyty, klidové a aktivované T-lymfocyty, transformované buněčné linie, folikulární lymfomy, CLL. Hierarchická analýza výsledků potvrdila předpoklad, že dosud pouze morfologicky a imunologicky definované jednotky, mají vzájemně odlišný profil genové exprese. Jedinou výjimkou se staly difúzní velkobuněčné B-lymfomy (DLBCL), které byly na podkladě profilu genové exprese rozděleny do dvou podskupin. První podskupina, jejíž profil genové exprese byl podobný profilu buněk vycházejících ze zárodečného centra (GC) lymfatického folikulu, dostala pracovní označení „GC B-like DLBCL“. Druhá podskupina se svým profilem podobala více aktivovaným B-lymfocytům, a proto byla pracovně označena „Activated B-like DLBCL“. Obě skupiny DLBCL nebylo možné od sebe žádnou jinou metodikou odlišit. Druhým překvapením bylo zjištění, že obě popisované skupiny DLBCL se vzájemně liší v parametrech celkového přežití a prognózy pacienta. Skupina GC B-like DLBCL vykazovala delší celkové přežití pacientů a predikovala dobrou prognózu, u skupiny Activated B-like DLBCL tomu bylo naopak (obr.č.3.)
[12]. Na tuto práci navázala M. Shipp, která analyzovala pomocí oDNA čipů 58 případů DLBCL. Chtěla najít souvislost mezi výsledky DNA čipové analýzy a vyléčitelností choroby. Pacienti byli rozděleni na dvě skupiny. V první byli ti, kteří dosáhli úplného vyléčení choroby (min. pět let v kompletní remisi), a ve druhé skupině pacienti s progresí choroby nebo ti, kteří v důsledku nemoci zemřeli. Použitá statistická analýza (supervised vector machine learning) identifikovala profily genové exprese, determinující uvedený průběh choroby [20]. Obě předchozí práce dokázaly pomocí DNA čipů odhalit nové molekulární prediktivní ukazatele (profil genové exprese) nezávislé na mezinárodním prognostickém indexu – IPI, který je standardně klinicky používán, a jehož omezená prediktivní výpověď je především u kategorie pacientů s IPI II a III. Zajímavou prací v hematoonkologii je rovněž publikace od Daviese, et al., která přinesla nové poznatky získané pomocí DNA čipů o mnohastupň ovém procesu transforamce MGUS do mnohočetného myelomu [21].
Další průlomovou práci vytvořila společně s T.R. Golubem S. Ramaswamy. Ta v roce 2001 publikovala výsledky DNA čipové analýzy 218 vzorků tumorů vycházejících ze 14 histologicky odlišných typů (adenoca prsu, prostaty, plic, kolorekta, pankreasu, ovárií, dělohy, lymfomy, leukémie, ca močového měchýře, ledvin, melanom, mesoteliom, nádory CNS). Správnost predikce zařazení testovaných vzorků do uvedených 14 skupin dosáhla při tak složitém systému téměř 80%. Aplikace těchto výsledků se dají očekávat zejména v diagnostice tumorů nejasného origa [22].
Stěžejní práce byly provedeny rovněž v oblasti nádorů prsu. Perou et al., opakovaně publikoval práce, ve kterých na základě profilu genové exprese postupně identifikoval 4 skupiny nádorů prsu. První byla charakterizována vysokou pozitivitou cytokeratinů luminálního typu – skupina „luminal-epithelial group“ Druhá expresí estrogenových receptorů. – „ER+ group“. Třetí skupina byla odlišitelná pomocí vysoké exprese HER2. Poslední skupina nádorů se vyznačovala tím, že jejich profil genové exprese se podobal profilu zdravé tkáně prsu. Nesla označení „normal breast like group“ „Luminal-epithelial group“, vykazovala v klinickém průběhu signifikantně horších výsledků, podobně jako HER2+ skupina. [23,24]. Hadenfalk et al., studoval užitím DNA čipů rozdílnosti mezi genovou expresí tumorů prsu nesoucích BRCA1 nebo BRCA2 mutaci. Mezi jinými identifikoval např. cyclin D1 jako jeden z genů, který byl odlišně exprimován v uvedených podskupinách. Jeho vysoká exprese byla především u tumorů s pozitivní BRCA2 mutací [25]. Van’t Veer et al., se zabýval analýzou genové exprese primárních vzorků karcinomu prsu, se v následujícím období vyskytly nebo naopak nevyskytovaly vzdálené metastázy. Pomocí 70 genů byl schopen predikovat metastázování nových pacientek s 89% přesností [26].
Podobnou práci publikoval u medulloblastomů MacDonald et al. Zjistil, že metastatický potenciál glioblastomů je úzce spjat s PDGFR (platelet derived growth factor receptor) a s RAS/MAPK cestou [27]. Toto zjištění dává možnosti cíleného terapeutického působení (Gleevec, a pod.). Pomeroy et al., analyzoval 99 vzorků tumorů CNS a definoval jejich molekulární klasifikaci pomocí genové exprese 50 genů. Na jejich podkladě pak dokázal vzájemně odlišit medulloblastomy od ostatních, histologicky podobných tumorů [27].
Do DNA čipové analýzy se vkládají velké naděje v souvislosti se stanovováním predikce chemosenzitivity a chemorezistence nádorů k jednotlivým cytostatikům. Biostatistické zpracování čipových dat umožň uje identifikovat profily genové exprese mající významný vztah k podmínkám experimentu a fenotypu testovaného subjektu (mechanismus lékové rezistence, farmakokinetiku, farmakodynamiku, farmakogenetiku) [1,29]. V roce 2001 J.E. Staunton a T.R. Golub publikovali v PNAS práci: „Chemosensitivity prediction by transcriptional profiling,“ ve které prostřednictvím DNA čipů analyzovali genovou expresi 60 odlišných nádorových linií používaných ve výzkumném programu National Cancer Institute v USA. Každá linie je testována na chemorezistenci vůči tisícům látek pomocí metabolického testu. Autoři se zaměřili na 232 látek z testované skupiny a identifikovali genové profily predikující chemosenzitivitu nebo chemorezistenci k vybraným 232 látkám [29]. Japonský tým Y. Nakamury publikoval práci věnující se chemorezistenci AML. Autoři postupně vyselektovali 28 genů, které dosahovaly statisticky významné rozdílnosti v expresi u skupiny chemosenzitivních a chemorezistentní pacientů k aplikované léčbě. Na podkladě tohoto zjištění vytvořili „Drug-response scoring“ predikční systém, který testovali na 64 vzorcích AML (zahrnujících 44 původních a 20 nových vzorků). Jejich systém úspěšně předpověděl odpověď pacientů na léčbu v 57 případech [30]

Závěr
Základní dogma informačního toku v biologických systémech (DNA>RNA>protein>fenotyp) dává předpoklad tomu, že biologické koreláty genové exprese jsou identifikovatelné. Uvedený přehled prací to dokládá. I přesto je potřeba mít při interpretaci DNA čipových dat na paměti, že jsou zatíženy falešně pozitivními výsledky, že popisují pouze jeden stupeň informačního toku, a proto nemohou plně postihnout post-transkripční a post-translační děje, proteinové interakce a komplexní in-vivo podmínky. V poslední souvislosti je velká naděje vkládána do kombinace čipové analýzy s proteomickými metodami, včetně slibně se rozvíjejících „proteinových čipů“ [31].

Literatura
[1] Weber, B. A., Cancer Cell, 2002, Vol. 1: 37-47.
[2] Ramaswamy, S., et al, JCO, 2002, Vol. 20:1932-1941.
[3] Svoboda, M., Michálek, J., Lékař a technika, přijato do tisku 2003.
[4] Schena, M., et al., Science, 1995, Vol. 270:467-470.
[5] Duggan, D., et al., Nature Gen., 1999, Vol. 21:10-14.
[6] Schulze, A., et al., Nature Cell Biol., 2001, Vol. 3:E190-5.
[7] Eberwine, J.,et al., PNAS, 1992, Vol. 89:3010-4
[8] Alizadeh, A. A., et al, J. Pathol., 2001, Vol. 195: 41-52.
[9] Basarsky, T., et al., Eaton Publishing, Sunnyvale, 2000, pp, 265-285.
[10] Weinstein, J. N., et al., Cytometry, 2002, Vol. 47:46-49.
[11] Ringner, L., et al., Pharmacogenomics, 2002, Vol. 3:403-415.
[12] Alizadeh, A. A., et al., Nature, 2002, Vol. 403: 503-511.
[13] Stoeckert, Ch. J., et al., Nature Gen., 2002, Vol. 32:469-473.
[14] Templin, F. M., et al., TRENDS in Biotech., 2002, Vol. 20:160-166.
[15] Golub, T. R. et al., Science. 286: 531-537
[16] Armstrong, S. A., et al. Nat. Genet., 2002, Vol. 30:41-47.
[17] Yeoh, E. J., et al. Cancer Cell, 2002, Vol. 1:133-143.
[18] Virtaneva, K., et al. PNAS, 2001, Vol.98:1124-1129.
[19] Schoch, C., et al. PNAS, 2002, Vol.99:10008-10013
[20] Shipp, M. A., et al. NATURE MEDICINE, 2002, Vol. 8: 68-74
[21] Davies, F. E., et al. Diagn Mol Pathol., 2003, Vol. 12:63-70.
[22] Ramaswamy, S., et al. PNAS, 2001, Vol. 98: 15149-15154
[23] Perou, C. M., et al. Nature, 2000, Vol. 406:747-752.
[24] Sorlie, T. et al. PNAS, 2001,Vol. 98:10869-10874.
[25] Hedenfalk, I., et al. NEJM, 2001, Vol. 344:539-548.
[26] van’t Veer, l. J., et al. Nature, 2002, Vol. 415:530-536
[27] MacDonald, T. J., et al. Nature Genet., 2001, Vol. 29:143-152.
[28] Pomeroy, S. L., et al., Nature, 2002, Vol. 415:436-442.
[29] Staunton, J. E., et al. PNAS,2001, Vol. 98: 10787-10792
[30] Okutsu, J. et al. Molecular Cancer Therapeutics, 2002, Vol. 1: 1035-1042
[31] Slonim, D. K., Pharmacogenomics, 2000, Vol. 2:123-136.
[32] Astier, A. A., Svoboda, M., et al. Blood, 2003, Vol. 101:1118-1127