Identifikace a funkční analýza mikroRNA s deregulovanou expresí u kolorektálního karcinomu.

   Úvod

   Kolorektální karcinom (CRC) patří mezi nejčastější nádorová onemocnění v České republice a je druhou nejčastější příčinou nádorových úmrtí v západních zemích (Siegel et al., 2011). Hlavními důvody vysoké mortality jsou diagnóza v pokročilých stádiích onemocnění a nedostatečná klinická klasifikace, která neumožňuje zařadit pacienty do příslušných skupin na základě rizika relapsu onemocnění, a umožnit tak vytvoření individuálního léčebného plánu. Vzhledem k těmto skutečnostem je proto nezbytné nalézt nové biomarkery, které by umožnily časnou diagnózu bezpříznakového onemocnění, přesné odlišení jednotlivých klinických stádií a individualizaci léčby.

   Jedním z nejmodernějších přístupů současné molekulární charakterizace solidních nádorů je analýza mikroRNA (miRNA). MiRNA jsou krátké nekódující jednořetězcové RNA o délce 18-25 nukleotidů, které posttranskripčně regulují genovou expresi (Janga et al., 2011). Hrají důležitou roli v mnoha biologických procesech, jakými jsou diferenciace, apoptóza, buněčný cyklus, proliferace či metastázování (Cho et al., 2007). Početné studie již prokázaly rozdílnou expresi některých miRNA mezi nádorovou tkání a zdravou střevní sliznicí u pacientů s CRC (Slabý et al., 2007; Bandrés et al., 2006; Schetter et al., 2008), jejich přesná úloha v patogenezi tohoto onemocnění však nebyla dosud přesně popsána.

   Cíle studie

   Hlavním cílem této studie bylo analyzovat expresní profily 667 miRNA u pacientů s kolorektálním karcinomem a s použitím moderních biostatistických metod identifikovat miRNA s deregulovanou expresí u CRC. Několik takto identifikovaných miRNA bylo dále validováno a testováno in vitro s cílem analyzovat jejich vliv na viabillitu, buněčný cyklus, apoptózu a migraci buněk DLD-1 a HCT-116.

   Materiál a metody

   V první fázi studie byly analyzovány expresní profily 667 miRNA metodou kvantitativní Real-Time PCR arrays (TaqMan Low-Density Arrays – TLDA) u 63 důkladně klinicky charakterizovaných pacientů s kolorektálním karcinomem a 8 zdravých paralelních sliznic. S použitím moderních biostatistických metod byly identifikovány miRNA rozdílně exprimované v nádorové tkáni a zdravé střevní sliznici a dále byly nalezeny miRNA specifické pro jednotlivá klinická stádia. Vybrané signifikantní miRNA byly dále validovány na novém souboru 125 párových vzorků pocházejících rovněž od pacientů s CRC, a to pomocí kvantitativní real-time PCR. Následně byla analyzována korelace mezi expresí těchto miRNA a klinicko-patologickými znaky pacientů.

   V in vitro analýzách byly použity buněčné linie DLD-1 a HCT-116, které byly transfekovány příslušnými prekurzory či inhibitory zkoumaných miRNA pomocí LipofectamineTM RNAiMAX (Invitrogen). Vliv jednotlivých miRNA na viabilitu buněk byl měřen pomocí MTT testu, pro měření buněčného cyklu a apoptózy bylo využito značení propidium iodidem či annexinem a buňky byly následně analyzovány pomocí průtokové cytometrie. Rychlost migrace buněk byla hodnocena s využitím tzv. ‘scratch wound assaye’.

   Výsledky a diskuze

   S použitím moderních biostatistických metod bylo identifikováno 42 miRNA s rozdílnou expresí mezi nádorovou tkání a zdravou střevní sliznicí (P < 0,0005) a dále byl sestaven klasifikátor, který na základě exprese 4 miRNA dokázal odlišit pacienty ve II. a III. klinickém stádiu se senzitivitou 89 % a specificitou 62 %. Exprese všech 4 miRNA byla vyšší u pacientů s postižením RLU, přesné zapojení těchto miRNA do procesu metastázování však nebylo dosud popsáno.

   Na základě těchto výsledků, předchozích pozorování a biologické významnosti bylo vybráno 14 miRNA pro další validaci, která potvrdila významně snížené hladiny miR-378 (P < 0.0001), miR-422a (P < 0.0001), miR-375 (P < 0.0001), miR-451 (P < 0.0001), miR-378* (P < 0.0001), miR-215 (P < 0.0001), miR-145 (P = 0.0370), miR-195 (P = 0.0032) a miR-139-5p (P = 0.0002) a významně zvýšenou hladinu miR-135b (P < 0.0001), miR-21 (P < 0,0001) a miR-31 (P < 0.0001) v nádorové tkáni. Zároveň byla prokázána souvislost mezi sníženými hladinami miR-215 (P < 0,0001) a miR-422a (P < 0,0001) a klinickým stádiem nemoci (kromě stádia IV) a dále byly pozorovány nejvyšší hladiny miR-135b u pacientů v I. klinickém stádiu (P = 0,0003), což je v souladu s dřívějšími předpoklady, že tato miRNA hraje důležitou roli v počátečních fázích neoplastické transformace (Nagel et al., 2008). Současně bylo prokázáno, že vzorky nádorové tkáně s nižší expresí miR-215 se vyznačují vyšším gradem (P = 0,0388). Významným závěrem byla rovněž skutečnost, že exprese miR-215 (P < 0,0001), miR-422 (P = 0,0002), miR-378 (P = 0,0415) a miR-135b (P = 0,0013) úzce souvisela s pozitivitou RLU. Přestože tento fakt nevyplynul z výsledků expresního profilování, individuální assaye naznačují, že by tyto miRNA mohly hrát důležitou roli v procesu metastázování. V neposlední řadě byla též zjištěna přímá souvislost mezi zvýšenou expresí miR-135b a vyššími pre-operačními hladinami CEA (P = 0,0338) a CA19-9 (P = 0,0360). Toto pozorování je v souladu s předchozími pozorováními, jež popisují zvýšené hladiny miR-135b v plazmě pacientů s CRC, což poukazuje na možnost využití této miRNA jako nového biomarkeru (Ng et al., 2009).

   Výsledky in vitro analýz prokázaly, že zvýšená exprese miR-215 vedla k poklesu ve viabilitě HCT-116 buněk o 21,7 ± 0,3 % (P = 0,05) a DLD-1 buněk o 19,7 ± 7,1 % (P = 0,05) 48 h po transfekci 10nM pre-miR-215. Podobně také vyšší hladina miR-375 způsobila pokles v počtu živých HCT-116 buněk o 32,9 ± 6,9 % (P = 0,005). V případě miR-378 vedla zvýšená exprese k snížení viability DLD-1 buněk o 14,4 ± 12,4 % (P = 0,05) 48 h po transfekci 10nM pre-miR-378. Viabilitu buněk rovněž ovlivnila miR-135b, kdy nižší hladiny této miRNA vedly k snížení životnosti DLD-1 buněk o 27,4 ± 19,2 % (P = 0,005) a HCT-116 buněk o 16,0 ± 11,7 % (P = 0,05) 48 h po transfekci 30nM anti-miR-135b. Tato pozorování jsou v souladu s naším předpokladem, že miR-215, miR-375 a miR-378 fungují jako nádorové supresory, zatímco miR-135b plní funkci onkogenu.

   Analýzy buněčného cyklu prokázaly, že miR-215, miR-375, miR-378 a miR-422a významně zvyšují podíl buněk v G0-G1 fázi a snižují počet buněk v S fázi u buněčné linie HCT-116 (ve všech případech P = 0,01), nikoliv však u buněčné linie DLD-1. Podobně zvýšené hladiny miR-215 vedly vzestupu v počtu apoptotických HCT-116 buněk z 14,6 ± 2,1 % na 36,2 ± 5,1 % (P = 0,005). Tato skutečnost pravděpodobně souvisí s mutací p53 u buněk DLD-1 (Braun et al., 2008). Pomocí ‘scratch wound assaye’ bylo dále zjištěno, že zvýšená exprese miR-215 snižuje migraci DLD-1 buněk o 46,1 ± 20,5 % (P = 0,05) a HCT-116 buněk o 26,6 ± 35,2 % (P > 0,05). Podobný výsledek byl pozorován i v případě miR-21, kdy snížení hladiny této onkogenní miRNA pomocí transfekce 50nM anti-miR-21 vedlo ke snížení migrace DLD-1 buněk o 27,8 ± 9,9 % (P = 0,016). Toto pozorování je v souladu s předchozími studiemi, které popsaly přímou inhibici tumor supresorových genů TIMP3, PDCD4 (Selaru et al., 2009), PTEN (Wang et al., 2011), TPM1 (Zhu et al., 2007), RECK (Ziyan et al., 2010) a genu pro maspin (Torres et al., 2011) prostřednictvím vazby miR-21, což vedlo k aktivaci enzymů degradujících matrix a následně ke zvýšené buněčné migraci, invazivitě a tvorbě vzdálených metastáz.

   Závěr

   Závěrem lze shrnout, že byla jednoznačně prokázána tumor supresorová funkce miR-378, miR-422a, miR-375 a miR-215, zatímco miR-135b a miR-21 lze označit jako onkogeny. Výsledky této studie dále naznačují případné využití validovaných miR- NA jako nových biomarkerů u CRC a funkční screening potvrdil, že některé z nich, především potom miR-215, představují potenciálně významné cíle při léčbě tohoto onemocnění. Přesné molekulární mechanizmy však nejsou dosud známy a bude jim porozuměno teprve v případě, že se podaří identifikovat a experimentálně validovat cílové molekuly těchto miRNA.

Literatura

1. Bandrés E, Cubedo E, Agirre X, et al. Identification by Real-time PCR of 13 mature microRNAs differentially expressed in colorectal cancer and non-tumoral tissues. Mol Cancer 2006; 5:29.
2. Braun CJ, Zhang X, Savelyeva I, et al. p53-Responsive MicroRNAs 192 and 215 Are Capable of Inducing Cell Cycle Arrest. Cancer Res 2008; 68:10094–104.
3. Cho WCS. OncomiRs: the discovery and progress of microRNAs in cancers. Mol Cancer 2007; 6:60.
4. Janga SC, Vallabhaneni S. MicroRNAs as post-transcriptional machines and their interplay with cellular networks. Adv Exp Med Biol 2011; 722:59–74.
5. Nagel R, le Sage C, Diosdado B, et al. Regulation of the adenomatous polyposis coli gene by the miR-135 family in colorectal cancer. Cancer Res 2008; 68:5795–802.
6. Ng E. K., Chong W. W., Jin H., Lam E. K, et al. Differential expression of microRNAs in plasma of patients with colorectal cancer: a potential marker for colorectal cancer screening. Gut 2009; 58(10): 1375-1381
7. Schetter AJ, Leung SY, Sohn JJ, et al. MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA 2008; 299:425–36.
8. Selaru F. M., Olaru A. V., Kan T., David S., et al. MicroRNA-21 is overexpressed in human cholangiocarcinoma and regulates programmed cell death 4 and tissue inhibitor of metalloproteinase 3. Hepatology 2009; 49:1595-1601
9. Siegel R, Ward E, Brawley O, Jemal A. Cancer statistics, 2011. CA: A Cancer Journal for Clinicians 2011; 61:212–36.
10. Slaby O, Svoboda M, Fabian P, et al. Altered expression of miR-21, miR-31, miR-143 and miR-145 is related to clinicopathologic features of colorectal cancer. Oncology 2007; 72:397–402.
11. Torres A., Torres K., Paszkowski T., Radej S., et al. Highly increased maspin expression corresponds with up-regulation of miR-21 in endometrial cancer: a preliminary report. Int J Gynecol Cancer 2011; 21:8-14.
12. Wang X., Wang J., Ma H., et al. Downregulation of miR-195 correlates with lymph node metastasis and poor prognosis in colorectal cancer. Med Oncol 2011; [Epub ahead of print]
13. Zhu S., Si M. L., Wu H., Mo Y. Y. MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1). J Biol Chem 2007; 282:14328-14336.
14. Ziyan W., Shuhua Y., Xiufang W., Xiaoyun L. MicroRNA-21 is involved in osteosarcoma cell invasion and migracion. Med Oncol 2010; 28(4): 1469-1474

Práce byla podpořena grantem IGA MZ NS/9814-4/2008 a výzkumným záměrem MZ0MOU2005.