Hypoxií indukovaná rezistence k cisplatině u neuroblastomu – studie in vitro

Úvod

Normální parciální tlak kyslíku se v organismu pohybuje v rozmezí od 150 mm Hg sloupce v horních dýchacích cestách až po hranici 5 mm Hg v sítnici. Hypoxie (pO₂ < 40 mm Hg v arteriální krvi) je stav sníženého parciálního tlaku kyslíku, který omezuje funkci orgánů, tkání a buněk. Většina solidních nádorů obsahuje hypoxické oblasti (pO₂ < 5 mm Hg) v důsledku neadekvátního zásobení rychle rostoucích nádorů kyslíkem a četných abnormalit nádorové vaskulatury („chaotické“ uspořádání cév – absence hierarchické struktury, trombotizace, zvýšená propustnost cévní stěny a další).

Odpověď na hypoxii zahrnuje na buněčné úrovni změnu glykolýzy z aerobní na anaerobní a expresi stresových proteinů, které se podílejí na regulaci buněčné smrti a buněčného metabolizmu. Hypoxií indukovaný transkripční faktor-1 (HIF-1) je hlavním regulátorem hypoxické odpovědi buněk. HIF-1 aktivuje transkripci více než 100 genů, které jsou zásadní v adaptaci buněk a tkání na hypoxické prostředí. Je to heterodimerní transkripční faktor tvořený dvěmi podjednotkami, regulovanou HIF-α a konstitutivně exprimovanou HIF-1β/ARNT. V současné době jsou popsány tři isoformy HIF-α podjednotky (HIF-1α, HIF-2α, HIF-3α). HIF-1α je exprimován ubikviterně, na rozdíl od tkáňově specifické exprese HIF-2α. HIF-3α má četné varianty, které vznikají alternativním sestřihem pre-mRNA genu HIF-3α – varianty HIF-3α1 až HIF-3α6. Některé z těchto variant jsou dobře definované inhibitory proteinů s PAS doménou, tzn. i proteinů HIF-1α a 2α (inhibice heterodimerizace s HIF-1β/ARNT). Přesto, HIF-3α může také heterodimerizovat s HIF-1β/ARNT a aktivovat transkripci HIF cílových genů. HIF-1α je kontinuálně exprimován v hypoxickém prostředí i přes celkové snížení translace proteinů. Stabilita a aktivita HIF-1α proteinu je regulována ubiquitinproteozomální degradací v závislosti na dostupnosti kyslíku. V aerobních podmínkách je HIF-α hydroxylován specifickými prolylhydroxylasami (PHD1-3) na prolinových zbytcích v oxygen-dependentní degradační doméně (ODD). HIF-α hydroxylace v ODD umožňuje vazbu pVHL a následnou poly-ubiquitinaci a proteosomální degradaci. V hypoxických podmínkách (<5% O₂) je aktivita PHDs inhibována. Aktivita PHDs je spojena s oxidačním stavem iontu Fe2+, který je jejich kofaktorem. Hypoxie způsobuje odchylky mitochondriálního transportního řetězce a zvyšuje úroveň reaktivních forem kyslíku, které alterují oxidační stav Fe²⁺ → Fe³⁺, který nemůže být využit jako kofaktor PHDs (Semenza, 2001). Na aktivitě a degradaci HIF se také podílí některé další dráhy, zejména de-ubiquitinylace (USP20), oxygen-independentní regulace (p53-Hdm2), regulace SUMOylací, pVHL-nezávislé regulace (HSP90, RACK1). Oxygen-dependentní regulace HIF prostřednictvím pVHL dráhy je nejlépe prostudovaná a také je pravděpodobně dominantním způsobem degradace HIF proteinů (Yee Koh et al., 2008). Hypoxie a exprese HIF-1α proteinu ovlivňuje intratumorální buněčnou heterogenitu, podporuje vznik nádorového stromatu, indukuje novotvorbu cév a zvyšuje rezistenci nádorových buněk k cytostatikům i radioterapii. Exprese HIF-1α je u některých typů nádorů nezávislým prognostickým znakem a podílí na nepříznivé prognóze.

Podíl HIF-α na chemorezistenci není zcela znám. V literatuře je popsáno, že inhibice HIF-1α může zvrátit hypoxií indukovanou rezistenci nádorových buněk vůči doxorubicinu a cisplatině (Hussein et al., 2006). Na druhé straně je hypoxie silným buněčným stresovým faktorem a indukuje některé proapoptotické proteiny bcl-2 rodiny v závislosti na expresi HIF-α podjednotek.

Cíle práce

Ověřit vliv hypoxie a exprese HIF-1α na rezistenci vůči cytostatikům, na expresi proapoptoických proteinů a na změny buněčného cyklu u buněčných linií odvozených od neuroblastomu vysokého rizika typu N i typu S.

Výsledky

V hypoxii se výrazně zvýšila rezistence na cisplatinu. Zvýšení rezistence bylo z části závislé na buněčném typu NBL. Rezistence UKF-NB-4, S buněčný typ neuroblastomu, byla za hypoxie vyšší než u téže linie s in vitro navozenou rezistencí na cisplatinu UKF-NB-4^cddp. U buněčné linie UKF-NB-3, N buněčný typ neuroblastomu, byla za normoxie i za hypoxie vždy méně citlivá linie s in vitro navozenou rezistencí na cisplatinu UKF-NB-3^cddp. Buněčné linie kultivované za hypoxie měly nižší procento proliferační frakce buněčného cyklu (S+G2/M fáze), apoptózy a prodloužený zdvojovací čas. Hypoxií navozená rezistence nesouvisela se prodloužením zdvojovacího času.

Exprese HIF-1α proteinu byla závislá na buněčné linii a době kultivace v hypoxii (1% kyslíku) a kulminovala po 4-8 hodinách hypoxie u obou typů neuroblastomu. U linie UKF-NB4 nebyl HIF-1α po 12 hodinách kultivace v hypoxii detekován na rozdíl od linie UKF-NB-3, kde exprese přetrvávala ještě po 72 hodinách kultivace v hypoxii. Dynamika exprese HIF-1α proteinu neměla vztah k rezistenci na cisplatinu. Inhibice HIF-α chetominem částečně zvrátila hypoxií navozenou rezistenci na cisplatinu (snížení viability a zvýšení cisplatinou indukované apoptózy).

Hypoxie indukovala zvýšenou expresi proapoptotických proteinů caspasy 8 a BNIP3. Exprese byla závislá na době kultivace a buněčném typy neuroblastomu. BNIP3 byl exprimován u obou buněčných typů neuroblastomu. Exprese BNIP3 byla vyšší u S typu než u N typu a závislá na době kultivace buněk v hypoxii. U N typů neuroblastomu, kde bývá exprese caspasy 8 často epigeneticky potlačena, nedošlo k ovlivnění její exprese hypoxií. U S typu neuroblastomu došlo k masivnímu zvýšení její exprese.

Závěr

Hypoxie navozuje rezistenci na cisplatinu. Snížení proliferační frakce buněk resp. prodlužení zdvojovacího času buněčných linií neuroblastomu nesouvisí s hypoxií indukovanou chemorezistencí. Exprese proapoptotických proteinů caspasy 8 a BNIP3 byla významně vyšší u S typů NBL, přestože v hypoxii vykazovaly výrazně nižší procento apoptózy než buněčné linie N typu. Buňky S typu neuroblastomu jsou méně tumorigenní, ale jsou více rezistentní k protinádorové léčbě. Jedním z důvodů jejich nižší citlivosti může být i jejich schopnost adaptace na hypoxické podmínky.

Literatura

1. Hussein D, Estlin EJ, Dive C, Makin GW. Chronic hypoxia promotes hypoxia-inducible factor-1alpha-dependent resistance to etoposide and vincristine in neuroblastoma cells. Mol Cancer Ther. 2006 Sep;5(9):2241-50.
2. Semenza GL. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathofysiology Trends Mol Med 2001 Aug;7(8):345-50.
3. Yee Koh M, Spivak-Kroizman TR, Powis G. HIF-1 regulation: not so easy come, easy go. Trends Biochem Sci 2008 Nov;33(11):526-534.

Práce vznikla za podpory MŠMT (MSM0021620813) a GAUK 72208/2008.