Hladina metalothioneinu v krevním séru u primárních záchytů solidních nádorů dětského věku.

Úvod

Časná diagnostika nádorových onemocnění v dětském věku mimořádně obtížná především kvůli jejich vzácnosti a nespecifické symptomatologii. Pro úspěšnou terapii těchto onemocnění se však jedná o zcela zásadní krok.

Incidence dětských nádorů je 130-140 nových onemocnění /1000 000 dětí ročně. V České republice představují méně než 1 % zhoubných nádorových onemocnění v populaci. Nádorová onemocnění představují po úrazech druhou nejčastější příčinu úmrtí v dětském věku (UZIS). Většina nádorových onemocnění u dětí patří mezi biologicky agresivní choroby s vysokým růstovým potenciálem (mitotickou aktivitou). Značná biologická aktivita, a tedy i rychlost růstu těchto nádorů poskytuje pouze málo času pro včasné zahájení léčby. Zachytit nádorové onemocnění v časném stadiu je u dětí velmi obtížné, protože počáteční příznaky jsou zejména u malých dětí velmi nespecifické. Diagnostika zahrnuje časově náročné zobrazovací metody, vyšetření mozkomíšního moku, detailní vyšetření nádorové tkáně, stanovení hormonů a nádorových markerů. Pro diagnostiku jsou u některých nádorů využívány nádorové markery především stanovení a-fetoproteinu, p-podjednotky choriového gonadotropinu a placentární alkalické fosfatasy, většina nádorů dětského věku však nemá žádný specifický nádorový marker (Churackova). Ukazuje se, že jedním z možných markerů nádorového onemocnění je na cysteiny bohatý malý protein - metalothionein (MT) (Masarik et al.). Jednou z nejznámějších funkcí tohoto proteinu je detoxifikace a udržování homeostasy těžkých kovů v živočišných organismech (Coyle et al.; Eckschlager et al.). Nyní je známo, že MT hraje roli i v regulaci genové exprese, transkripce, embryogeneze, a imunomodulaci, kromě toho bylo zjištěno, že má také antiapoptotickou funkci. V případě nádorových onemocnění je spojován s jejich diagnostikou, průběhem, prognosou a metastatováním. Zvýšená exprese MT vede ke vzniku rezistence nádorových buněk k cytostatikům (Krizkova et al.; Krizkova et al.; Krizkova et al.; Pedersen et al.). V řadě uveřejněných publikací bylo zjištěno, že hladina MT v krvi a krevním séru pacientů s nádorovým onemocněním je několikanásobně zvýšená ve srovnání se zdravými jedinci (Krizkova et al.; Petrlova et al.). Pro stanovení MT byla vyvinuta automatizovaná elektrochemická technika umožňující rutinní analýzu velkého množství vzorků (Fabrik et al.). Tato metoda vykazuje vysokou senzitivitu a reprodukovatelnost pro stanovení MT v biologickém vzorku a především je vhodná k detekci MT z krevního séra.

V této práci jsme se zaměřili na stanovení hladin MT u primárních záchytů nejčastějších solidních dětských tumorů pomocí automatizované elektrochemické detekce MT.

Experimentální část

Materiál a metody

Vzorky byly analyzovány na přístroji 747 VA Stand ve spojení s 746 VA Trace Analyzer a 695 Autosampler (Metrohm, Švýcarsko) (Obr. 1a) v klasickém tříelektrodovém uspořádání. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm²; referentní elektrodou byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou platinová elektroda. Základní elektrolyt (1 mmol/l (Co(NH₃)₆)Cl₃ a 1 mol/l a amonný pufr; NH3(aq) + NH₄Cl, pH 9,6) byl po každých pěti měřeních vyměněn. DPV parametry byly následující: počáteční potenciál -0,7 V, konečný potenciál -1,75 V, modulační čas 0,057 s, časový interval 0,2 s, potenciálový krok 2 mV/s, modulační amplituda -250 mV, Eads = 0 V, teplota základního elektrolytu 4 °C. Vzorky sér pacientů s nádorovým onemocněním byly získány z Kliniky dětské hematologie a onkologie 2. Lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze - Motole. Kontrolní vzorky byly získány z Ústavu sportovní medicíny, Brno. Vzorky byly připraveny následujícím způsobem; krev byla po čas 15-ti minut ponechána při 99 °C (Eppendorf 5430, USA), poté byly vzorky centrifugovány při 16 000 g, 4 °C po dobu 30 minut (Eppendorf 5402, USA). Následovalo odebrání supernatantu, který byl přímo analyzován.

Výsledky a diskuse

Metalothionein jako biomarker nádorového onemocnění byl sledován u pacientů s meduloblastomem (n = 10), neuroblastomem (n = 12), osteosarkomem (n = 8), Ewingovým sarkomem (n = 4) a anaplastickým ependymomem (n = 4). Kromě toho byla hladina MT stanovena také u zdravých jedinců (n = 58). Pro jeho detekci jsme zvolili v klinické praxi nezvyklé elektrochemické metody, které se vyznačují velkou sensitivitou, selektivitou a ekonomickou nenáročností. Dále jsme kladli důraz na automatizaci detekce, abychom metodu co nejvíce přiblížili potřebám klinické praxe na rychlé a standardizované laboratorní vyšetřovací metody. Pro tento úkol jsme použili ve střední Evropě ojedinělé přístrojové sestavy, která právě toto umožňuje při malé potřebě biologického materiálu.




Obr. 1

• (a) Schéma zapojení automatického dávkovače 695 Autosampler do elektrochemického analyzátoru 747 VA Stand. Signály jsou transportovány do 746 VA Trace Analyzeru, kde jsou následně vyhodnoceny.
  
• (b) Závislost výšky signálu na koncentraci standardu MT
  
• (c) Voltamogramy elektrolytu a standardů MT
  
• (d) voltamogramy vzorku krevního séra pacientů s melanomem, neuroblastomem, ependymomem, Ewingovým sarkomem a osteosarkomem, voltamogram vzorku krevního séra kontrolního jedince

Výsledkem elektrochemické analýzy pomocí Brdičkovy reakce jsou proudové odpovědi. Mechanismus reakce je složitý a jeho povaha je zčásti katalytického původu. Poslední signál (Cat2) (Obr. 1b, 1c) je výsledkem redukce vodíkových iontů, který je přímo úměrný hladině metalothioneinu ve vzorku. Všechny vzorky pocházely z primárních záchytů nádorového onemocnění. Výsledné koncentrace ukazují na výrazně zvýšenou hladinu MT u nemocných oproti kontrolní skupině. Stanovené průměrné hladiny MT byly u meduloblastomu (4.15 ± 0.57 jxM), u osteosarkomu (3.6 ± 1.1 jxM), neuroblastomu (3.49 ± 0.97 jxM), anaplastického ependymomu (3.39 ± 0.31 uM) aEwingova sarkomu (2.94 ± 1.1 uM). U kontrol byla průměrná hladina MT 0.51 ± 0,20 uM. Výsledky byly testovány na hladině významnosti p < 0.05 (t-test). Z výsledků vyplývá, že sérová hladina MT u většiny pacientů s nádorovým onemocněním je nejméně 5 x vyšší než u zdravých jedinců (viz. Obr. 2), MT je proto slibným diagnostickým mar-kerem nádorových onemocnění.



Obr. 2

Průměrná hladina metalothioneinu u jednotlivých nádorových onemocnění (anaplastický ependymom, Ewingův sarkom, meduloblastom, neuroblastom, osteosarkom) a kontrol. Výsledky byly testovány na hladině významnosti p < 0.05 (t-test).

Role MT v karcinogenezi je doposud nedostatečně objasněna, přítomnost MT v krevním séru má pravděpodobně spojitost s metastatováním, invazivitou a růstem nádoru. Kromě toho bylo zjištěno, že zvýšená exprese MT v nádorových buňkách je spojována s rezistencí tumoru k cytostatikům a může být použita jako prediktivní marker. Před vlastním zavedením do klinické diagnostiky ještě zbývá zjistit, jak se hladiny MT mění za různých fyziologických i patologických situací (věk, menstruační cyklus, námaha, infekce, stav po traumatu či operaci, podávání léků).

Závěr

Naše výsledky ukazují, že elektrochemické stanovení MT by po dalším prověření mohlo posloužit jako další vhodný marker solidních nádorů dětského věku a eventuálně i u dalších maligních nádorů.

Poděkování

Práce byla podporována grantovým výzkumnými projekty: GACR 301/09/P436, IGAMZ10200-3 a GAAVIAA401990701. Literatura

1. Coyle, P., et al., (2002): Metallothionein: The multipurpose protein. Cellular and Molecular Life Sciences, 59: 627-647.
2. Eckschlager, T., et al., (2009): Metallothioneins and Cancer. Current Protein & Peptide Science, 10: 360-375.
3. Fabrik, I., et al., (2008): Employment of electrochemical techniques for metallothionein determination in tumor cell lines and patients with a tumor disease. Electroanalysis, 20: 1521-1532.
4. Churackova, M., (2008): Nádory centrálního nervového systému u dětí a mladistvých. Onkologie, 2: 234-238.
5. Krizkova, S., et al., (2009): Using of chicken antibodies for metallothionein detection in human blood serum and cadmium-treated tumour cell lines after dot and electroblotting. Electrophoresis, 30: 3726-3735.
6. Krizkova, S., et al., (2009): Study of metallothionein oxidation by using of chip CE. Electrophoresis, 30: 4029-4033.
7. Krizkova, S., et al., (2009): Metallothionein - a promising tool for cancer diagnostics. Bratisl. Lek. Listy, 110: 93-97.
8. Krizkova, S., et al., (2008): Utilizing of adsorptive transfer stripping technique Brdicka reaction for determination of metallothioneins level in melanoma cells, blood serum and tissues. Sensors, 8: 3106-3122.
9. Masarik, M., et al., (2009): Detection of metallothionein and alpha-methylacyl CoA racemase as potential new markers for prostate carcinoma. International Journal of Molecular Medicine, 24: 276.
10. Pedersen, M. O., et al., (2009): The role of metallothionein in oncogenesis and cancer prognosis. Progress in Histochemistry and Cytochemistry, 44: 29-64.
11. Petrlova, J., et al., (2006): Determination of metallothionein content in patients with breast and colon cancer, and malignant melanoma. Klinicka Onkologie, 19: 138-142.
12. UZIS, Č. R., 2009. Novotvary 2006. Ústav zdravotnických informací a statistiky ČR, Národní onkologický registr ČR, Praha