HLA-G a HLA-E konotují protichůdný prognostický význam u karcinomu ledviny: HLA-E funguje kontraintuitivně k pT stadiu, Fuhrmannové jadernému gradingu a prognóze. Možné implikace pro imunoterapii.

   Neklasické humánní leukocytární antigeny G a E (HLA-G a HLA-E) byly původně považovány za specifické pouze pro extravilózní trofoblast: prvotně popsaná funkce spočívala v protekci fetálního semiallogeneického graftu před mateřskou allorekognicí (“pregnancy sentinels“).

   Nyní je známo že HLA-G a HLA-E mají mnoho imunoregulačních funkcí. HLA-G je využívána četným malignitami pro svoje imunotolerogenní resp. imunosuperesívní charakteristiky. Funkce imunomodulační molekuly HLA-E je komplexnější: jde o molekulu s duální funkcí v závislosti na obsazovaných receptorech na NK buňkách. Tato molekula může působit jak imunoaktivačně, tak imunotolerogenně/imunosupresivně.

   Karcinom z renálních buněk (RCC) je charakterizován svou rezistencí na radioterapii a/nebo chemoterapii, ale na druhé straně je to jeden z tumorů který je imunogenní – je schopen stimulovat protinádorovou odpověď.

   Cíl

   Prognostický význam exprese HLA-G neoplastickými buňkami RCC není dosud zcela jasný a význam exprese HLA-E v RCC nebyl dosud studován vůbec. Tohoto důvodu jsme v naší studii hodnotili expresní hladiny HLA-G a HLA-E specifických mRNA transkriptů neoplastickými buňkami u 38 případů RCC.

   Materiál a metodika

   Pacienti

   38 pacientů (24 mužů, 14 žen) diagnostikovaných s RCC světlobuněčného typu v MOÚ Brno mezi lety 2003 až 2009 bylo zahrnuto do studie. Věk pacientů byl mezi 41 a 89 lety, s mediánem 68 let. Histologické diagnózy byly stanoveny v souladu s poslední WHO klasifikací. Případy byly selektovány podle dostupnosti nativní tkáně a nebyly stratifikovány vzhledem k žádnému předoperačnímu či prognostickému faktoru. Klinické follow-up údaje byly získány prostřednictvím každoročního sledování. Žádný pacient nedostal neoadjuvantní terapii včetně event. biologické terapie/imunoterapie. Medián sledování byl 40 měsíců s rozptylem od 3 do 105 měsíců.

   Příprava tkáňových vzorků, RNA purifikace, reverzní transkripce a real-time qPCR

   Pod dohledem zkušeného patologa bylo nashromážděno 48 tkáňových vzorků z resekovaných tkání – 38 vzorků z primárních tumorů (RCC) a 10 vzorků z okolního nenádorového ledvinného parenchymu. Všechny vzorky byly ihned uloženy do tekutého dusíku až do doby RNA extrakce. Vzorky byly homogenizovány (Retch MM301) za sterilních podminek a RNA izolace byla provedena za použití RNeasy Mini Kit (Qiagen) podle instrukcí výrobce. Celková RNA koncentrace a čistota byla kontrolována UV spektrofotometricky (A260:A280 > 2.0; A260:A230 > 1.8) za použití Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, USA).

   DNA byla získána reverzní transkripcí (Thermocycler Tgradient; Biometra). Za tímto účelem reakční směs obsahující 1ug celkové RNA, hexamery (Qiagen) a vodu zbavenou ribonukleáz byla inkubována při 65 °C po dobu 5 minut a poté prudce ochlazena na ledu. Následující komponenty byly dodány do celkového objemu 20 μL: 5X reakční pufr, inhibitor ribonukleázy, dNTP mix, Revert AidTM MMuLV H-Reverse Transcriptase Fermentas) a voda zbavená ribonukleáz. Směs byla inkubována po dobu 120 minut při 42 °C, poté byla reakce zastavena ohřátím směsi na 95 °C po dobu 5 minut a ochlazena na ledu. Real-time PCR reakce byla provedena za použití Applied Biosystems 7500 Sequence Detection System dle instrukcí výrobce. PCR směs, s celkovým objemem 20 μL, obsahovala 4 μL produktu reverzní transkripce, 10 μl of 2X TaqMan Universal PCR Master Mix, 1 μL 20X primerů a sondy TaqMan Expression Assays pro HLA-G (Hs00365950_g1) a HLA-E (Hs03045171_m1) a 5 μl vody zba- vené ribonukleáz. Směs byla inkubována v 96-komůrkové optické plotně při 50 °C po dobu 2 minut, 95 °C po dobu 10 minut, následovalo 40 cyklů při teplotě 95 °C po dobu 15 vteřin a 60 °C po dobu 1 minuty. Všechny reakce byly provedeny dvojmo a byly spočítány průměrné Ct a hodnoty standardní deviace.

   Statistická analýza

   Hladiny exprese byly normalizeovány dle exprese referenčního genu GAPDH (Assay No. 402869; Applied Biosystems). Statistické rozdíly mezi klinickopatologickými parametry a hladinami mRNA byly zhodnoceny prostřednictvím Mann–Whitney U-testu mezi dvěma nezávislými skupinami a Wilcoxon testem mezi párovými skupinami a Kruskal-Wallis testem pro 3 nebo vice skupin. Long-rank test byl použit k hodnocení rodílů Kaplan–Meier křivkách. P-hodnoty nižší než 0.05 byly považovány za signifikantní. Všechny analýzy byly provedeny pomocí software Statistica (StatSoft Inc., version 6.0, Tulsa, OK, USA).

   Výsledky

   HLA-G specifické mRNA transkripty nebyly – vyjma jednoho vzorku – přítomny v normálním ledvinném parenchymu. Na druhé straně, HLA-G specifické mRNA transkripty byly přítomny ve tkáních RCC ve 29 případech (z 38, t. j. u 76 %) a byla přítomna korelace mezi přítomností HLA-G specifických mRNA transkriptů v RCC tkáni a normálním ledvinném parenchymu (p=0,031 pro párové vzorky, p=0,006 pro nepárové vzorky). HLA-E specifické mRNA transkripty však byly přítomny jak v normálním ledvinném parenchymu, tak ve tkáni RCC ve všech vzorcích a nebyla identifikována žádná korelace mezi přítomností HLA-E specifických mRNA transkriptů ve tkáních RCC a normálním renálním parenchymu (p=0,82 pro párové vzorky, p=0,14 pro nepárové vzorky). Délka doby do relapsu negativně korelovala s expresními úrovněmi HLA-G specifických mRNA transkriptů (cut off = 75 percentil HLA-G expresních úrovní ve tkáních RCC; p=0,0401, Long-rank test). Naopak délka doby do relapsu pozitivně korelovala s expresními úrovněmi HLA-E specifických mRNA transkriptů (cut off = 25 percentil HLA-E expresních úrovní ve tkáních RCC; p=0,0115, Long-rank test).

   Žádná korelace nebyla nalezena mezi expresí HLA-G specifických mRNA transkriptů a pT stadiem (p=0,2649; Mann-Whitney test) a jaderným gradingem dle Fuhrmannové (p=0,1949, Mann-Whitney test).

   Mezi expresí HLA-E specifických mRNA transkriptů a pT stadiem byla nalezena pozitivní statistická korelace (p=0,041; Mann-Whitney test). Dále byla nalezena pozitivní statistická korelace mezi expresí HLA-E specifických mRNA transkriptů a jaderným gradingem dle Fuhrmannové (p=0.0423, Kruskal-Wallis test).

   Diskuse

   Naše výsledky potvrdily již popsanou [1] téměř kompletní down-regulaci exprese HLA-G v téměř všech vzorcích normáního ledvinného parenchymu a její re-expresi v RCC. Ačkoliv byla dosud publikována pouze jedna velká studie zabývající se speci- ficky analýzou možného prognostického významu HLA-G re-exprese u RCC [2] a tato studie neprokázala negativní prognostický význam HLA-G re-exprese, naše pozorování podporují tuto roli HLA-G v RCC negativním ovlivněním doby do relapsu. Tento pozorovaný immune-tolerogennní efekt je v souladu jak s fyziologickou funkcí HLA-G, tak s většinou publikací které hodnotí negativní vliv HLA-G positivity v nádorových buňkých různých histotypů vzhledem k prognóze. Aberantní exprese HLA-G je přítomna v relativně vysokém počtu RCC a může participovat v úniku nádorových buněk před imunitním dozorem inhibicí lýzy imunitními efektorovými buňkami. Navíc byla popsána aberantní aktivace HLA-G exprese v RCC buněčných liniích vlivem interferonů [1,3,4]. Lze tedy spekulovat, pokud vezmeme v úvahu imunotolerogenní funkci dosud přičítanou HLA-G molekule, že tento indukční efekt interferonů by mohl snížit či možná zcela eliminovat efekt imunoterapie (a vysvětlit, přinejmenším zčásti, špatnou resp. žádnou odpověď některých pacientů na imunoterapii).

   Na rozdíl od HLA-G, exprese a funkce HLA-E v neoplastických procesech zůstává špatně pochopena s kontradiktorními literárními údaji. Většina údajů v literatuře svědčí pro horší prognózu patientů s HLA-E pozitivními tumory různých histotypů [5-8]. Avšak, existují nečetné publikace které kontraintuitivně (vztaženo k fyziologické imunotolerogenní funkci HLA-E v trofoblastu) naznačují lepší prognózu pacientů s HLA-E pozitivními tumory [9-11]. V naší studii jsme prokázali že HLA-E speci- fické mRNA transkripty jsou přítomny jak v normální, tak v nádorové ledvinné tkáni. Hlavně ale naše výsledky rovněž indikují pozitivní vliv na délku doby do relapsu u pacientů jejichž RCC tkáně vykazují vysoké koncentrace HLA-E specifických mRNA transkriptů. Navíc, zdá se že existuje pozitivní korelace mezi vysokými koncentracemi HLA-E specifických mRNA transkriptů v neoplastických buňkách a lepším pT stadiem a nižším jaderným gradingem dle Fuhrmannové. Vysvětlení tohoto kontraintuitivního efektu HLA-E u RCC může být přímé obsazení CD94/NKG2C aktivačních receptorů místo CD94/NKG2A inhibičních receptorů [12]. Další možností je antigenpecifická rekognice skrze T buněčné receptory exprimované na T lymfocytech [13].

   Poslední možnost je aktivace kompetice NKG2A-mediovanou inhibicí využitím peptidů z dárcovských proteinů jiných než HLA I třídy (např. heat peptidy apod.): HLA-E molekuly v komplexu s těmito signálními peptidy už nejsou rozpoznávány CD94/ NKG2A inhibičními receptory. Interference těchto peptidů postupně znemožní CD94/NKG2A inhibiční rekognici [14]. Naše výsledky tedy naznačují, že rovnováha mezi aktivačními a inhibičními funkcemi multifunkční imuno-modulační molekuly HLA-E v RCC favourizuje aktivační odpovědi namísto tolerogenního efektu.

   Pokud se týká abearantní aktivace HLA-E exprese v různých buněčných liniích (jiných než RCC) vlivem interferonů, tento efekt byl rovněž popsán [15-18]. Za zmínku stojí, že jedna studie [19] prokázala opačný efekt různých inferferonů (alfa vs. gamma) na efektorové buňky: interferon-alfa stimuluje expresi stimulačních CD99/NKG2D receptorů a inhibuje expresi inhibičních CD94/NKG2A receptorů na NK buňkách, zatímco interferon gamma inhibuje cytolýzu nádorových buněk NK buňkami expresí MICA nebo HLA-E povrchových proteinů.

   Shrnutí

   Poprvé jme popsali negativní prognostický vliv HLA-G a pozitivní prognostický vliv HLA-E u RCC. Tyto molekuly mohou tedy reprezentovat přínosné prognostické biomarkery u RCC. Dále jsme poprvé popsali pozitivní vliv HLA-E na lepší pT stadium a na lepší jaderný grade dle Fuhrmannové. Vzhledem ke známé aberaci aktivace HLA-G a HLA-E exprese vlivem interferonů, potom by identifikace HLA-G a HLA-E statusu mohla mít vliv na design neodjuvantní léby této choroby a přispět k lepší identifikaci pacientů, kteří by mohli potencionálně vice benefitovat z cíleně na míru stanovené neoadjuvantní biologické/imunologické terapie.

Literatura

1. Ibrahim EC, Guerra N, Lacombe MJ, Angevin E, Chouaib S, Carosella ED, Caignard A, Paul P. Tumor-specific up-regulation of the nonclassical class I HLA-G antigen expression in renal carcinoma. Cancer Res 2001; 61:6838-6845.
2. Li BL, Lin A, Zhang XJ, Zhang X, Zhang JG, Wang Q, Zhou WJ, Chen HX, Wang TJ, Yan WH. Characterization of HLA-G expression in renal cell carcinoma. Tissue Antigens 2009; 74:213-221.
3. Bukur J, Rebmann V, Grosse-Wilde H, Luboldt H, Ruebben H, Drexler I, Sutter G, Huber C, Seliger B. Functional role of human leukocyte antigen-G up-regulation in renal cell carcinoma. Cancer Res 2003; 63:4107-4111.
4. Dunker K, Schlaf G, Bukur J, Altermann WW, Handke D, Seliger B. Expression and regulation of non-classical HLA-G in renal cell carcinoma. Tissue Antigens 2008; 72:137-148
5. Bossard C, Bézieau S, Matysiak-Budnik T, Volteau C, Laboisse CL, Jotereau F, Mosnier JF. HLA-E/β2 microglobulin over-expression in colorectal cancer is associated with recruitment of inhibitory immune cells and tumor progression. Int J Cancer 2011 Sep 22. doi:9.1002/ijc.26453. [Epub ahead of print].
6. de Kruijf EM, Sajet A, van Nes JG, Natanov R, Putter H, Smit VT, Liefers GJ, van den Elsen PJ, van de Velde CJ, Kuppen PJ. HLA-E and HLA-G expression in classical HLA class I-negative tumors is of prognostic value for clinical outcome of early breast cancer patients. J Immunol 2010; 185:7452-7459.
7. Levy EM, Bianchini M, Von Euw EM, Barrio MM, Bravo AI, Furman D, Domenichini E, Macagno C, Pinsky V, Zucchini C, Valvassori L, Mordoh J. Human leukocyte antigen-E protein is overexpressed in primary human colorectal cancer. Int J Oncol 2008; 32:633-641.
8. Gooden M, Lampen M, Jordanova ES, Leffers N, Trimbos JB, van der Burg SH, NijmanH, van Hall T. HLA-E expression by gynecological cancers restrains tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108:10656-10661.
9. Benevolo M, Mottolese M, Tremante E, Rollo F, Diodoro MG, Ercolani C, Sperduti I, Lo Monaco E, Cosimelli M, Giacomini P. High expression of HLA-E in colorectal carcinoma is associated with a favorable prognosis. J Transl Med 2011; 9:184.
10. John T, Black MA, Toro TT, Leader D, Gedye CA, Davis ID, Guilford PJ, Cebon JS: Predicting clinical outcome through molecular profiling in stage III melanoma. Clin Cancer Res 2008; 14:5173-5180.
11. Mandruzzato S, Callegaro A, Turcatel G, Francescato S, Montesco MC, Chiarion-Sileni V, Mocellin S, Rossi CR, Bicciato S, Wang E, Marincola FM, Zanovello P: A gene expression signature associated with survival in metastatic melanoma. J Transl Med 2006; 4:50.
12. Braud VM, Allan DSJ, O'Callaghan CA, Söderström K, D'Andrea A, Ogg GS, Lazetic S, Young NT, Bell JI, Phillips JH, Lanier LL, McMichael AJ: HLA-E binds to natural killer cell receptors CD94/NKG2A, B and C. Nature 1998; 391:795-799
13. Moretta L, Romagnani C, Pietra G, Moretta A, Mingari MC: NK-CTLs, a novel HLA-E-restricted T-cell subset. Trends Immunol 2003, 24:136-143.
14. Michaëlsson J, Teixeira de Matos C, Achour A, Lanier LL, Kärre K, Söderström K.A signal peptide derived from hsp60 binds HLA-E and interferes with CD94/NKG2A recognition. J Exp Med. 2002; 196:1403-1414.
15. Gustafson KS, Ginder GD. Interferon-gamma induction of the human leukocyte antigen-E gene is mediated through binding of a complex containing STAT1alpha to a distinct interferon-gamma-responsive element. J Biol Chem. 1996; 271:20035- 20046
16. Malmberg KJ, Levitsky V, Norell H, de Matos CT, Carlsten M, Schedvins K, Rabbani H, Moretta A, Söderström K, Levitskaya J, Kiessling R. IFN-gamma protects short-term ovarian carcinoma cell lines from CTL lysis via a CD94/NKG2A-dependent mechanism. J Clin Invest 2002; 110:1515-1523.
17. Derré L, Corvaisier M, Charreau B, Moreau A, Godefroy E, Moreau-Aubry A, Jotereau F, Gervois N. Expression and release of HLA-E by melanoma cells and melanocytes: potential impact on the response of cytotoxic effector cells. J Immunol 2006; 177:3100-3107.
18. Nguyen S, Beziat V, Dhedin N, Kuentz M, Vernant JP, Debre P, Vieillard V. HLA-E upregulation on IFN-gamma-activated AML blasts impairs CD94/NKG2A-dependent NK cytolysis after haplomismatched hematopoietic SCT. Bone Marrow Transplant 2009; 43:693-699.
19. Zhang C, Zhang J, Sun R, Feng J, Wei H, Tian Z. Opposing effect of IFNgamma and IFNalpha on expression of NKG2 receptors: negative regulation of IFNgamma on NK cells. Int Immunopharmacol 2005; 5:1057-1067.

Podpořeno části grantem IGA NS/10361-3/2009 No. MZ0MOU2005, dále projektem „CEITEC – Central European Institute of Technology” (CZ.1.05/1.1.00/02.0068) Operational Program Research and Development for Innovations (project CZ.1.05/2.1.00/01.0030).