Genetické a expresní změny spojené s chemorezistencí k ellipticinu u buněčné linie neuroblastomu

Úvod: Neuroblastom vysokého rizika (HR NBL) zůstává jedním z nejhůře léčitelných dětských nádorových onemocnění. HR NBL je charakteristický agresivním růstem a velmi nepříznivou prognózou bez ohledu na klinické stadium. S tím souvisí snaha o ovlivnění HR NBL novými léky. Jednou z hlavních příčin selhání chemoterapie je vznik rezistence na použitá cytostatika. Zaměřili jsme se na studium buněk HR NBL rezistentního na ne zcela běžně používané cytostatikum: ellipticin. Od 70. let byly polárnější deriváty ellipticinu využívány k léčbě karcinomu prsu s kostními metastázemi, akutní myeloblastické leukemie a karcinomu štítné žlázy. V současné době je zkoumáno i použití ellipticinů při léčbě AIDS. Za hlavní cytotoxický a protinádorový účinek ellipticinu a jeho derivátů je považována interkalace do DNA a inhibice topoizomerázy II alfa (TOPO2A). Ellipticin také selektivně inhibuje fosforylaci proteinu p53 v několika lidských nádorových buněčných liniích. Ellipticin rovněž odpřahuje oxidativní fosforylaci v mitochondriích, a tím narušuje energetickou rovnováhu buněk. Bylo také popsáno, že ellipticin zabraňuje proliferaci buněk regulací exprese cyklinu B1 a Cdc2 a fosforylaci Cdc2. Velmi důležitým aspektem pozorovaným při léčbě byla individuální variabilita v odpovědi pacientů na podané léčivo. Vysvětlením může být rozdílná enzymová výbava enzymy důležitými pro biotransformaci ellipticinu (cytochromy P450, cyklooxygenáza, myeloperoxidáza). Tyto enzymy aktivují léčivo na terapeuticky účinnější derivát, který nádorové buňky poškozuje efektivněji.

Výsledky: Lidská neuroblastomová linie UKF-NB-4 rezistentní na ellipticin (UKF-NB-4ELLI) byla získána dlouhodobým kultivováním buněk linie UKF-NB-4 (linie získaná z relapsu vysoce rizikového neuroblastomu do kostní dřeně). Komparativní geonomovou hybridizací (CGH) jsme vyšetřili HR NBL buněčnou linii UKF-NB-4ELLI. Možné změny chromozomových oblastí jsme ověřovali metodou FISH, která nám umožňuje, při použití specifické sondy, zjistit přesný počet konkrétních genů a chromozomů. Exprese genů jsme vyšetřili metodou RNA-microarray a ověřili metodou RT PCR. Byly nalezeny změny v expresi řady genů s možným významem za vznik chemorezistence. Za nejvýznamnější považujeme snížení exprese TOPO2A podpořené ztrátou zmnožení genu TOP2A u rezistentní linie. Dalším mechanizmem lékové rezistence je zvýšená exprese antiapoptotického genu Bcl-2. Rezistentní linie má oblast 18q21.3, s lokalizací genu Bcl-2, zmnoženou a expresi oproti senzitivní linii zvýšenou. Apoptózu je možné zablokovat i delecí genu BAX. UKFNB-4ELLI má oblast 19q s lokalizací genu BAX deletovanou. V chemorezistentní linii vymizelo zmnožení v oblasti 7q11.2-31.3, kde je lokalizován gen pro cytochrom P450 3A4. UKF-NB-4ELLI má oproti senzitivní linii sníženou tumorigenicitu a in vivo v nunu myších roste pomaleji.

Diskuze a závěry: Z našich výsledků vyplývá, že rezistence na použité cytostatikum je jev složitý, spojený s mnohočetnými změnami chromozomů a podmíněný řadou mechanizmů, které mohou, ale také nemusí korelovat se změnami na chromozomech. Oblasti chromozomů, kde jsou lokalizovány geny MDR1 (7q21), MRP1(16p13), LRP1 (12q13-14) bývá u chemorezistentních nádorů zmnožená nebo amplifikovaná. Linie UKF-NB-4ELLI žádné takové změny nemá. U linie UKF-NB-4 rezistentní na doxorubicin (UKF-NB-4DOXO), která má gen MDR1 amplifikovaný, byla průtokovým cytometrem potvrzena vysoká exprese P-glykoproteinu (P-gp). U linie UKF-NB-4ELLI nebyla exprese P-gp prokázána, což odpovídá snížené expresi MDR1 na úrovni mRNA. Z našich nálezů vyplývá, že ač jsou mechanizmy působení doxorubicinu a ellipticinu na buňky podobné (interkalace DNA, inhibice TOP2A), ellipticin není přes P-gp vypuzován, a mechanizmy chemorezistence jsou u UKFNB-4ELLI a UKF-NB-4DOXO rozdílné. Jedinými změnami, které odpovídají popsaným mechanizmům, jsou snížení exprese TOPO2A a zvýšená exprese Bcl-2, podpořené delecí genu BAX, což zabraňuje
buňce vstoupit do apoptózy.

Práce vznikla za finanční podpory GAUK 7926/2007, IGA MZ 1A8696-4/2005 a MŠMT VZ č. 0021620813.