Funkční analýza teplotně závislých mutantů p53 v kvasinkových a lidských buňkách.

Nádorový supresor p53 je sekvenčně specifický transkripční faktor, který pod vlivem buněčného stresu transaktivuje své cílové geny a podílí se tak na kontrole buněčného cyklu, regulaci apoptózy a oprav DNA. V současné době je popsáno více než 1500 různých mutací genu p53. Nejčastěji to jsou mutace bodové, které mění sekvenčně specifickou vazbu p53 na DNA v promotorech cílových genů a mají za následek ztrátu jeho transaktivační aktivity. Mutace v genu p53 lze úspěšně
detekovat funkční analýzou separovaných alel v kvasinkách („functional analysis of separated alleles in yeast“ – FASAY). Tato metoda využívá schopnosti lidského proteinu p53 fungovat v kvasinkách Sacchoromyces cerevisiae jako transkripční faktor a následné transkripce cílového genu ADE2. Bílé kvasinkové kolonie na selekčním médiu jsou tvořeny kvasinkami, které exprimují standardní p53, a červené kolonie kvasinkami, které exprimují nefunkční p53. Velkou výhodou metody FASAY je, že umožňuje odlišit i částečně inaktivující mutace, které si v permisivních podmínkách alespoň částečně zachovávají transaktivační aktivitu a tvoří růžové kvasinkové kolonie. S využitím metody FASAY jsme z různých lidských nádorů získali 23 teplotně závislých (td) mutací p53. V kvasinkovém expresním systému jsme studovali jejich funkční vlastnosti vzhledem ke třem různým responsibilním elementům (RE) odvozeným z promotorových oblastí cílových genů p53 (p21, bax, RGC) v teplotách 25, 30 a 35°C. Všechny td mutanty p53 jsme také exprimovali v lidských nádorových buňkách H1299 odvozených od plicního karcinomu. Opět jsme provedli analýzu jejich transaktivačních schopností vzhledem k vybraným RE (p21, bax, RGC) v teplotách 32 a 37°C. Ze srovnání obou analýz vyplynulo, že td mutanti p53 se chovají velmi podobně jak v kvasinkovém tak i lidském expresním systému. Shodně vykazují teplotní závislost a diskriminativní charakter (tzn. k různým RE se vážou s různou mírou afinity). Analýza transaktivačních schopností td mutantů p53 v lidských buňkách založená na měření luciferázové aktivity představuje citlivější přístup pro určení míry transaktivace. Umožňuje například odhalit td mutanty s vyšší transaktivační schopností než jakou má standardní p53. FASAY, založená na odečítání fenotypu kvasinkových kolonií, toto neumožňuje. Na druhou stranu FASAY spolehlivě odhalí teplotní závislost těch mutantů, u nichž se aktivita p53 obnovuje až v nižší teplotách, než při jakých jsou úspěšně kultivovány lidské buňky. Oba přístupy mají své nesporné výhody. Metoda FASAY však zůstává vhodnější pro rutinní analýzu stavu p53 z klinického materiálu. Je rychlejší, levnější, přiměřeně časově náročná a jak jsme ukázali, je v detekci mutací p53 spolehlivá

Tato práce byla podpořena grantem MSM 0021622415.