Funkční analýza separovaných alel v kvasinkách: spolehlivá metoda k určení statutu nádorového supresoru p53

Nádorový supresor p53 je sekvenčně specifický transkripční faktor, který se váže na DNA a řídí expresi mnoha svých cílových genů jako odpověď na buněčný stres. Somatické mutace genu p53 patří k nejčastěji detekovaným mutacím u lidských nádorů. Zárodečné mutace genu p53 jsou nejčastější příčinou vzácného dědičného onemocnění Li-Fraumeniho syndromu. Pro detekci mutací p53 lze použít několik různých metod, mezi nimi také funkční analýzy separovaných alel v kvasinkách (functional analysis of separated alleles in yeast – FASAY).

FASAY je citlivá semikvantitativní metoda používaná k detekci mutací p53 v klinickém materiálu (v nádorové tkáni, v buňkách periferní krve, apod.). Metoda využívá reparačního mechanismu na principu homologní rekombinace („gap repair“), který se uplatňuje v kvasinkových buňkách, a také faktu, že lidský protein p53 funguje v kvasinkách jako transkripční faktor. Transkripčně aktivační schopnost p53 odvozeného metodou RT-PCR z vyšetřované tkáně je v kvasinkových buňkách testována s využitím reportérského genu ADE2. Míra transaktivační schopnosti p53 je hodnocena podle zbarvení kvasinkových kolonií, které rostou na plotnách s nízkou hladinou adeninu. K výhodám FASAY patří, (1) že analyzuje obě alely genu p53 odděleně, (2) vysoká citlivost – zachytí asi 10% buněk s mutací p53, (3) možnost rozlišit plně inaktivující mutace p53 od částečně inaktivujících, (4) analyzuje podstatnou část genu p53 (kodóny 67-346) a (5) umožňuje přípravu templátů pro sekvenování DNA. Mezi nevýhody patří to, že nezachytí určité typy mutací (např. mutace vedoucí k alternativnímu sestřihu, mutace v promotoru), neanalyzuje celý gen p53 a výchozí analyzovanou molekulou je RNA, která se rychle degraduje.

Poděkování: Práce je podporována grantem IGA MZ ČR č. NR/8068-3.