Konference: 2005 XXIX. Brněnské onkologické dny a XIX. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: Pokroky v molekulární biologii nádorů
Číslo abstraktu: 045
Autoři: PharmDr. Lenka Adámková - Humpolíková, Ph.D.; K. Skalická; RNDr. Aleš Kovařík, CSc.; Mgr. Miloslava Fojtová, CSc.; RNDr. Vladimír Boudný, CSc.; RNDr. Ludmila Lauerová, CSc.; Prof. RNDr. a PharmDr. Jan Kovařík, DrSc.
Úvod do problematiky
Signální dráha JAK/STAT je jednou z klíčových signálních kaskád, které zprostředkovávají přenos signálů indukovaných cytokiny a růstovými faktory z buněčného povrchu do jádra. Odpovědí na externí stimulaci je modulace ligand-dependentních genetických programů, které hrají důležitou roli v základních fyziologických procesech jako jsou například diferenciace, proliferace, apoptóza a angiogeneze (Kisseleva et al., 2002; Calo et al., 2003). Analýza signální dráhy JAK/STAT provedená u širokého spektra primárních nádorů a stabilizovaných buněčných linií odvozených z nádorů naznačuje, že tato dráha může být u maligních buněk porušena překvapivě často a na mnoha úrovních. Dále bylo zjištěno, že abnormální signalizace zprostředkovaná JAK/STAT dráhou může ovlivnit vnímavost nádorové buňky na imunoterapeutickou léčbu. Proto je dnes věnována značná pozornost jednak objasnění vzájemných vztahů mezi jednotlivými členy této dráhy včetně reakce na externí stimulaci, jednak zapojení JAK/STAT dráhy do širšího spektra buněčné signalizace. Lze předpokládat, že bližší poznání poruch v signalizačních dráhách umožní vybrat u onkologických pacientů vhodnou a cílenou imunoterapeuticky zaměřenou léčbu.
V dnešní době jsou známy dvě skupiny proteinů signální kaskády JAK/STAT, které se podílí na přenosu signálu k cílovým genům. Jedná se o receptor-asociované Janusovy tyrozinproteinkinázy (Janus Tyrosin Kinases, JAKs) a přenašeče signálu a aktivátory transkripce (Signal Transducers and Activators of Transcription, STATs) (Rawlings et al., 2004; Boudny and Kovarik,2002). Intenzivní pozornost je také věnována negativním regulátorům této signální dráhy. Asi největší a nejdůležitější skupinou inhibitorů jsou supresory cytokinové signalizace (Supresors of cytokine signalig, SOCSs), dalšími negativními regulátory jsou fosfatázy (Protein Tyrosine Phosphatases, PTPs) a proteinové inhibitory aktivovaných STATů (Protein Inhibitors of Activated STATs, PIASs).
U savců bylo zatím identifikováno sedm genů kódujících STAT proteiny (STAT 1, 2, 3, 4, 5a, 5b a 6), které se vzájemně liší primární strukturou i funkcí (Calo et al., 2003; Bowman et al., 2000). STAT proteiny se nachází v cytoplazmě v inaktivním stavu, k aktivaci dochází až po vazbě ligandu (cytokinu, růstového faktoru) na příslušný receptor na povrchu buňky. Po interakci receptoru s ligandem je spuštěna řada molekulárních procesů, které zahrnují dimerizaci receptorů a vazbu JAK proteinkináz k receptorům. JAK proteinkinázy se vzájemně aktivují fosforylací na tyrozinových zbytcích (autofosforylace) a obratem pak fosforylují tyrozin na cytoplazmatickém konci receptorů, čímž vytvoří vazebná místa („docking sites“) pro monomerní STAT proteiny. Po vazbě k receptorům jsou STAT proteiny pomocí JAK proteinkináz fosforylovány na konzervovaném tyrozinu, což po uvolnění z receptorů umožní jejich dimerizaci a přesun do buněčného jádra. Zde interagují s příslušnými DNA sekvencemi (zesilovači) v promotorech responzivních genů a společně s dalšími transkripčními regulátory aktivují expresi cílových genů. Je nutné dodat, že pro úspěšný přenos signálu a následnou transaktivaci genů pomocí STAT proteinů je nezbytná jejich fosforylace nejen na příslušných tyrozinových zbytcích, ale v některých případech i na zbytcích serinu. SOCS proteiny, které jsou příslušníky multigenové rodiny s osmi dosud identifikovanými členy (CIS, SOCS 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7), realizují svou inhibiční roli tím, že se váží na JAK proteinkinázy nebo na cytoplazmatickou část receptorů, čímž fyzicky brání vazbě STAT proteinů a jejich následné fysforylaci (aktivaci) (Rawlings et al., 2004). V poslední době se ukazuje, že také mohou hrát roli v proteolytické degradaci JAK proteinkináz i receptorů. SOCS proteiny jsou zapojeny do jednoduché negativní zpětnovazebné smyčky (Fujimoto and Naka, 2003). Přesný mechanismus působení SOCS molekul v signální dráze JAK/STAT není znám, nicméně řada studií potvrdila, že aktivované STAT proteiny stimulují transkripci SOCS genů. Vzniklé SOCS inhibitory pak zprostředkovávají inaktivaci STATů a současně také snižují svou expresi, čímž se regulační smyčka uzavírá a dochází k znovuobnovení odpovídavosti buňky na další externí signál.
Intenzivní výzkum na poli signalizace zprostředkované proteiny STAT/SOCS vede stále častěji k závěru, že nesprávná funkce těchto proteinů může mít dramatický dopad na základní procesy probíhající v buňce. Přibývají důkazy, že patologický přenos signálu nebo pozměněná míra exprese genů STAT/SOCS hraje významnou roli v biologii maligní buňky a v její vnímavosti na imunoterapii (Calo et al., 2003). Zvýšení (konstitutivní) či snížení exprese STAT proteinu, jejich aberantní aktivace (poruchy ve fosforylaci), změny ve struktuře (mutace), ale i alterace v STAT/SOCS interakcích jsou příčinou patologie těchto signálních procesů v nádorové buňce. Kontinuální signalizace u nádorových buněk může být také způsobena zvýšenou degradací SOCS proteinů nebo umlčením SOCS genů pomocí metylace.
Námi prezentovaná studie byla zaměřena na analýzu funkčních a expresních změn STAT/SOCS proteinů v souvislosti s aktivací této signální kaskády pomocí interferonů u buněk lidského maligního melanomu. Dosud je k dispozici jen málo studií, které podávají informaci o roli signalizace STAT/SOCS v souvislosti s exogenní interferonovou (IFN) léčbou (Kovarik et al., 2003). Některé výsledky však naznačují, že například abnormalní hladina proteinu STAT 1 nebo jeho aberantní aktivace pozitivně koreluje se sníženou odpovídavostí nádorových buněk na inhibiční účinek IFN-α. (Pansky et al., 2000; Wong et al., 1997)
Metodika a výsledky
Stimulace exprese SOCS 3 interferony
Exprese SOCS 3 na úrovni mRNA a proteinu byla studována metodou Northern a Western blotu. Bylo použito 18 dobře definovaných stabilizovaných buněčných linií lidského maligního melanomu, jako kontrola sloužily primární kultury lidských kožních keratinocytů (2 kultury) a fibroblastů (3 kultury).
Pro účely Northern blotu byly celkové RNA elektroforeticky rozděleny na agarózovém gelu, přeneseny na nylonovou membránu a následně hybridizovány s radioaktivně značenou SOCS 3 cDNA sondou. Pro kontrolu množství použité RNA byla provedena hybridizace se sondou pro konstitutivně exprimovaný gen GAPDH glyceraldehydfosfodehydrogenáza). S výjimkou několika buněčných linií byl u nestimulovaných buněk hybridizační signál SOCS 3 téměř nedetekovatelný. Po indukci buněk IFN-α (5000 IU/ml, 30 minut) jsme nepozorovali žádné výraznější zvýšení hybridizačního signálu SOCS 3, zatímco po stimulaci IFNγ (10 ng/ml, 30 minut) většina linií vykazovala zvýšený hybridizační signál (83 % případů).
Hladina proteinu SOCS 3 byla určena pomocí Western blot analýzy s použitím polyklonální protilátky proti proteinu SOCS 3 a jako kontrola množství proteinu sloužila protilátka ERK. Nebyly pozorovány žádné nebo jen velmi malé rozdíly v intenzitě signálu SOCS 3 mezi kontrolami (neindukované buňky) a buňkami ovlivněnými IFN-α (17 % případů). Indukční aktivita IFNγ byla výrazně vyšší (83 % případů), což je v korelaci s výsledky RNA analýz.
Fosforylace STAT 1 v buňkách maligního melanomu
Předpokládá se, že aktivace transkripční aktivity STAT 1 je zprostředkována fosforylací na tyrozinovém a serinovém aminokyselinovém zbytku. Za účelem studia, zda dochází k indukci exprese SOCS 3 pomocí transkripčního faktoru STAT 1, jsme určili hladiny fosforylace STAT 1 v kontrolních a IFN-indukovaných buňkách. Byly použity protilátky rozeznávající fosforylovaný tyrozin 701 a serin 727. U většiny buněčných linií byla fosforylace na tyrozinu indukována oběma interferony (78 % případů po indukci IFN-α a 89 % po IFN-γ), zatímco fosforylace serinových zbytků byla po působení interferonů méně efektivní (11 % případů po indukci IFN-α a 39 % po IFN-γ). V buňkách kožních keratinocytů a fibroblastů jsme nedetekovali žádné významné zvýšení fosforylace těchto aminokyselin.
Hladina exprese STAT 1 u melanomových buněk
Je známo, že exprese proteinu STAT 1 se liší u různých tkání a linií. Proto jsme pomocí Northern blotu stanovili hladiny STAT 1 mRNA v melanomových liniích, v primárních kulturách keratinocytů a fibroblastů. Z pomě ru expresních hladin STAT 1 a GAPDH vyplynulo, že všechny analyzované linie maligního melanomu měly v porovnání s normálními buňkami 2-3x sníženou hladinu mRNA pro STAT 1, přičemž tato hladina se nezměnila ani po působení interferony.
Závěr
Ukázali jsme, že IFN-γ , na rozdíl od IFN-α , účinně indukuje expresi SOCS 3 u buněk lidského maligního melanomu i u nemaligních buněk (kožní fibroblasty, keratinocyty). Tyto výsledky naznačují, že dráha přenosu interferonových signálů je v případě IFN-α jiná než pro IFN-γ. Aktivace exprese SOCS 3 pomocí IFN-γ byla ve většině případů doprovázena zvýšením fosforylace proteinu STAT 1. Na druhou stranu, působení IFN-γ vedlo ke zvýšení fosforylace STAT 1 bez zvýšení exprese proteinu SOCS 3, což ukazuje, že v případě působení IFN-γ protein SOCS 3 není pravděpodobně zapojen do procesů vedoucích k fosforylaci STAT1. Dále bylo zjištěno, že hladina STAT 1 mRNA byla u melanomových buněk 2-3x snížena v porovnání s kontrolními buňkami. S přihlédnutím k fosforylačnímu stavu STAT 1 u jednotlivých melanomových linií vyplývá, že pro antiproliferativní účinek interferonů je spíše než absolutní hladina proteinu důležitá míra fosforylace STAT 1.
Závěrem lze říci, že vyšetření změn v signální dráze JAK/STAT by v budoucnu mohlo sloužit jako nový nástroj k výběru pacientů s maligním melanomem, kteří by byli vhodní k imunoterapeutické léčbě interferony.
Práce byla podporována grantovými projekty IGA MZ ČR NC/7139-3, GA ČR 301/03/0370, AV ČR S5004010 a VVZ MZ 00020980502.
Literatura
Signální dráha JAK/STAT je jednou z klíčových signálních kaskád, které zprostředkovávají přenos signálů indukovaných cytokiny a růstovými faktory z buněčného povrchu do jádra. Odpovědí na externí stimulaci je modulace ligand-dependentních genetických programů, které hrají důležitou roli v základních fyziologických procesech jako jsou například diferenciace, proliferace, apoptóza a angiogeneze (Kisseleva et al., 2002; Calo et al., 2003). Analýza signální dráhy JAK/STAT provedená u širokého spektra primárních nádorů a stabilizovaných buněčných linií odvozených z nádorů naznačuje, že tato dráha může být u maligních buněk porušena překvapivě často a na mnoha úrovních. Dále bylo zjištěno, že abnormální signalizace zprostředkovaná JAK/STAT dráhou může ovlivnit vnímavost nádorové buňky na imunoterapeutickou léčbu. Proto je dnes věnována značná pozornost jednak objasnění vzájemných vztahů mezi jednotlivými členy této dráhy včetně reakce na externí stimulaci, jednak zapojení JAK/STAT dráhy do širšího spektra buněčné signalizace. Lze předpokládat, že bližší poznání poruch v signalizačních dráhách umožní vybrat u onkologických pacientů vhodnou a cílenou imunoterapeuticky zaměřenou léčbu.
V dnešní době jsou známy dvě skupiny proteinů signální kaskády JAK/STAT, které se podílí na přenosu signálu k cílovým genům. Jedná se o receptor-asociované Janusovy tyrozinproteinkinázy (Janus Tyrosin Kinases, JAKs) a přenašeče signálu a aktivátory transkripce (Signal Transducers and Activators of Transcription, STATs) (Rawlings et al., 2004; Boudny and Kovarik,2002). Intenzivní pozornost je také věnována negativním regulátorům této signální dráhy. Asi největší a nejdůležitější skupinou inhibitorů jsou supresory cytokinové signalizace (Supresors of cytokine signalig, SOCSs), dalšími negativními regulátory jsou fosfatázy (Protein Tyrosine Phosphatases, PTPs) a proteinové inhibitory aktivovaných STATů (Protein Inhibitors of Activated STATs, PIASs).
U savců bylo zatím identifikováno sedm genů kódujících STAT proteiny (STAT 1, 2, 3, 4, 5a, 5b a 6), které se vzájemně liší primární strukturou i funkcí (Calo et al., 2003; Bowman et al., 2000). STAT proteiny se nachází v cytoplazmě v inaktivním stavu, k aktivaci dochází až po vazbě ligandu (cytokinu, růstového faktoru) na příslušný receptor na povrchu buňky. Po interakci receptoru s ligandem je spuštěna řada molekulárních procesů, které zahrnují dimerizaci receptorů a vazbu JAK proteinkináz k receptorům. JAK proteinkinázy se vzájemně aktivují fosforylací na tyrozinových zbytcích (autofosforylace) a obratem pak fosforylují tyrozin na cytoplazmatickém konci receptorů, čímž vytvoří vazebná místa („docking sites“) pro monomerní STAT proteiny. Po vazbě k receptorům jsou STAT proteiny pomocí JAK proteinkináz fosforylovány na konzervovaném tyrozinu, což po uvolnění z receptorů umožní jejich dimerizaci a přesun do buněčného jádra. Zde interagují s příslušnými DNA sekvencemi (zesilovači) v promotorech responzivních genů a společně s dalšími transkripčními regulátory aktivují expresi cílových genů. Je nutné dodat, že pro úspěšný přenos signálu a následnou transaktivaci genů pomocí STAT proteinů je nezbytná jejich fosforylace nejen na příslušných tyrozinových zbytcích, ale v některých případech i na zbytcích serinu. SOCS proteiny, které jsou příslušníky multigenové rodiny s osmi dosud identifikovanými členy (CIS, SOCS 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7), realizují svou inhibiční roli tím, že se váží na JAK proteinkinázy nebo na cytoplazmatickou část receptorů, čímž fyzicky brání vazbě STAT proteinů a jejich následné fysforylaci (aktivaci) (Rawlings et al., 2004). V poslední době se ukazuje, že také mohou hrát roli v proteolytické degradaci JAK proteinkináz i receptorů. SOCS proteiny jsou zapojeny do jednoduché negativní zpětnovazebné smyčky (Fujimoto and Naka, 2003). Přesný mechanismus působení SOCS molekul v signální dráze JAK/STAT není znám, nicméně řada studií potvrdila, že aktivované STAT proteiny stimulují transkripci SOCS genů. Vzniklé SOCS inhibitory pak zprostředkovávají inaktivaci STATů a současně také snižují svou expresi, čímž se regulační smyčka uzavírá a dochází k znovuobnovení odpovídavosti buňky na další externí signál.
Intenzivní výzkum na poli signalizace zprostředkované proteiny STAT/SOCS vede stále častěji k závěru, že nesprávná funkce těchto proteinů může mít dramatický dopad na základní procesy probíhající v buňce. Přibývají důkazy, že patologický přenos signálu nebo pozměněná míra exprese genů STAT/SOCS hraje významnou roli v biologii maligní buňky a v její vnímavosti na imunoterapii (Calo et al., 2003). Zvýšení (konstitutivní) či snížení exprese STAT proteinu, jejich aberantní aktivace (poruchy ve fosforylaci), změny ve struktuře (mutace), ale i alterace v STAT/SOCS interakcích jsou příčinou patologie těchto signálních procesů v nádorové buňce. Kontinuální signalizace u nádorových buněk může být také způsobena zvýšenou degradací SOCS proteinů nebo umlčením SOCS genů pomocí metylace.
Námi prezentovaná studie byla zaměřena na analýzu funkčních a expresních změn STAT/SOCS proteinů v souvislosti s aktivací této signální kaskády pomocí interferonů u buněk lidského maligního melanomu. Dosud je k dispozici jen málo studií, které podávají informaci o roli signalizace STAT/SOCS v souvislosti s exogenní interferonovou (IFN) léčbou (Kovarik et al., 2003). Některé výsledky však naznačují, že například abnormalní hladina proteinu STAT 1 nebo jeho aberantní aktivace pozitivně koreluje se sníženou odpovídavostí nádorových buněk na inhibiční účinek IFN-α. (Pansky et al., 2000; Wong et al., 1997)
Metodika a výsledky
Stimulace exprese SOCS 3 interferony
Exprese SOCS 3 na úrovni mRNA a proteinu byla studována metodou Northern a Western blotu. Bylo použito 18 dobře definovaných stabilizovaných buněčných linií lidského maligního melanomu, jako kontrola sloužily primární kultury lidských kožních keratinocytů (2 kultury) a fibroblastů (3 kultury).
Pro účely Northern blotu byly celkové RNA elektroforeticky rozděleny na agarózovém gelu, přeneseny na nylonovou membránu a následně hybridizovány s radioaktivně značenou SOCS 3 cDNA sondou. Pro kontrolu množství použité RNA byla provedena hybridizace se sondou pro konstitutivně exprimovaný gen GAPDH glyceraldehydfosfodehydrogenáza). S výjimkou několika buněčných linií byl u nestimulovaných buněk hybridizační signál SOCS 3 téměř nedetekovatelný. Po indukci buněk IFN-α (5000 IU/ml, 30 minut) jsme nepozorovali žádné výraznější zvýšení hybridizačního signálu SOCS 3, zatímco po stimulaci IFNγ (10 ng/ml, 30 minut) většina linií vykazovala zvýšený hybridizační signál (83 % případů).
Hladina proteinu SOCS 3 byla určena pomocí Western blot analýzy s použitím polyklonální protilátky proti proteinu SOCS 3 a jako kontrola množství proteinu sloužila protilátka ERK. Nebyly pozorovány žádné nebo jen velmi malé rozdíly v intenzitě signálu SOCS 3 mezi kontrolami (neindukované buňky) a buňkami ovlivněnými IFN-α (17 % případů). Indukční aktivita IFNγ byla výrazně vyšší (83 % případů), což je v korelaci s výsledky RNA analýz.
Fosforylace STAT 1 v buňkách maligního melanomu
Předpokládá se, že aktivace transkripční aktivity STAT 1 je zprostředkována fosforylací na tyrozinovém a serinovém aminokyselinovém zbytku. Za účelem studia, zda dochází k indukci exprese SOCS 3 pomocí transkripčního faktoru STAT 1, jsme určili hladiny fosforylace STAT 1 v kontrolních a IFN-indukovaných buňkách. Byly použity protilátky rozeznávající fosforylovaný tyrozin 701 a serin 727. U většiny buněčných linií byla fosforylace na tyrozinu indukována oběma interferony (78 % případů po indukci IFN-α a 89 % po IFN-γ), zatímco fosforylace serinových zbytků byla po působení interferonů méně efektivní (11 % případů po indukci IFN-α a 39 % po IFN-γ). V buňkách kožních keratinocytů a fibroblastů jsme nedetekovali žádné významné zvýšení fosforylace těchto aminokyselin.
Hladina exprese STAT 1 u melanomových buněk
Je známo, že exprese proteinu STAT 1 se liší u různých tkání a linií. Proto jsme pomocí Northern blotu stanovili hladiny STAT 1 mRNA v melanomových liniích, v primárních kulturách keratinocytů a fibroblastů. Z pomě ru expresních hladin STAT 1 a GAPDH vyplynulo, že všechny analyzované linie maligního melanomu měly v porovnání s normálními buňkami 2-3x sníženou hladinu mRNA pro STAT 1, přičemž tato hladina se nezměnila ani po působení interferony.
Závěr
Ukázali jsme, že IFN-γ , na rozdíl od IFN-α , účinně indukuje expresi SOCS 3 u buněk lidského maligního melanomu i u nemaligních buněk (kožní fibroblasty, keratinocyty). Tyto výsledky naznačují, že dráha přenosu interferonových signálů je v případě IFN-α jiná než pro IFN-γ. Aktivace exprese SOCS 3 pomocí IFN-γ byla ve většině případů doprovázena zvýšením fosforylace proteinu STAT 1. Na druhou stranu, působení IFN-γ vedlo ke zvýšení fosforylace STAT 1 bez zvýšení exprese proteinu SOCS 3, což ukazuje, že v případě působení IFN-γ protein SOCS 3 není pravděpodobně zapojen do procesů vedoucích k fosforylaci STAT1. Dále bylo zjištěno, že hladina STAT 1 mRNA byla u melanomových buněk 2-3x snížena v porovnání s kontrolními buňkami. S přihlédnutím k fosforylačnímu stavu STAT 1 u jednotlivých melanomových linií vyplývá, že pro antiproliferativní účinek interferonů je spíše než absolutní hladina proteinu důležitá míra fosforylace STAT 1.
Závěrem lze říci, že vyšetření změn v signální dráze JAK/STAT by v budoucnu mohlo sloužit jako nový nástroj k výběru pacientů s maligním melanomem, kteří by byli vhodní k imunoterapeutické léčbě interferony.
Práce byla podporována grantovými projekty IGA MZ ČR NC/7139-3, GA ČR 301/03/0370, AV ČR S5004010 a VVZ MZ 00020980502.
Literatura
- Boudny, V. and Kovarik, J.: JAK/STAT signaling pathways and
cancer. Neoplasma 49 (2002) 349-55.
- Bowman, T., Garcia, R., Turkson, J. and Jove, R.: STATs in
oncogenesis. Oncogene 19 (2000) 2474-88.
- Calo, V., Migliavacca, M., Bazan, V., Macaluso, M., Buscemi,
M., Gebbia, N. and Russo, A.: STAT proteins: from normal control of
cellular events to tumorigenesis. J Cell Physiol 197 (2003)
157-68.
- Fujimoto, M. and Naka, T.: Regulation of cytokine signaling by
SOCS family molecules. Trends Immunol 24 (2003) 659-66.
- Kisseleva, T., Bhattacharya, S., Braunstein, J. and Schindler,
C.W.: Signaling through the JAK/STAT pathway, recent advances and
future challenges. Gene 285 (2002) 1-24.
- Kovarik, J., Boudny, V., Kocak, I., Lauerova, L., Fait, V. and
Vagundova, M.: Malignant melanoma associates with deficient
IFN-induced STAT 1 phosphorylation. Int J Mol Med 12 (2003) 335-40. - Pansky, A., Hildebrand, P., Fasler-Kan, E., Baselgia, L.,
Ketterer, S., Beglinger, C. and Heim, M.H.: Defective Jak-STAT
signal transduction pathway in melanoma cells resistant to growth
inhibition by interferon-alpha. Int J Cancer 85 (2000)
720-5.
- Rawlings, J.S., Rosler, K.M. and Harrison, D.A.: The JAK/STAT
signaling pathway. J Cell Sci 117 (2004) 1281-3.
- Wong, L.H., Krauer, K.G., Hatzinisiriou, I., Estcourt, M.J., Hersey, P., Tam, N.D., Edmondson, S., Devenish, R.J. and Ralph, S.J.: Interferon-resistant human melanoma cells are deficient in ISGF3 components, STAT1, STAT2, and p48-ISGF3gamma. J Biol Chem 272 (1997) 28779-85.
Datum přednesení příspěvku: 26. 5. 2005
