Farmakogenetické aspekty terapie thiopuriny: pilotní výsledky studia genotypu a farmakofenotypu thiopurin S-methyltransferázy u dětské ALL

Thiopurin S-methyltransferáza (TPMT) je cytoplasmatický enzym katalyzující S-methylaci aromatických a heterocyklických sulfhydrylových komponent thiopurinových léčiv včetně 6-thioguaninu, 6-merkaptopurinu a azathioprinu. Tato léčiva se používají v medicíně jako protinádorová léčiva a imunosupresiva při terapii autoimunitních onemocnění, hematoonkologických onemocnění u dětí, idiopatických střevních zánětů a při transplantacích. Z thiopurinových léčiv vznikají vlastní účinné thioguaninové metabolity, které se jako falešné báze inkorporují do nukleových kyselin a inhibují tak jejich transkripci. Dalším mechanismem cytotoxického a imunosupresivního účinku je inhibice de novo syntézy purinových nukleotidů zprostředkovaná dalším účinným metabolitem methylthioinosinmonofosfátem, vytvářeným alternativní metabolickou cestou. TPMT je tedy zásadní enzym pro biodegradaci thiopurinů na neaktivní a netoxické metabolity, jež jsou posléze vyloučeny z organismu. Dostatečná aktivita TPMT tak zabraňuje hromadění thioguaninových nukleotidů a vzniku vedlejších nežádoucích účinků při odbourávání thiopurinových léčiv jako jsou neurotoxicita, hepatotoxicita, myelosuprese, záněty sliznic atd.

Snížená metabolická aktivita enzymu TPMT je důsledkem funkčních polymorfizmů v kódující oblasti genu TPMT, z nichž mezi nejčastější deficitní alely v indoevropské populaci patří G238C (označení TPMT*2), A719G (TPMT*3A) a A719G (TPMT*3C) a méně častá G460A (TPMT*3B). U běžné populace neléčené thiopuriny se polymorfizmus TPMT neprojevuje. Klinické projevy deficitu TPMT mohou být závažné pro léčené heterozygoty a homozygoty pro funkčně variantní alely a genetické polymorfizmy tak značnou měrou predisponují pacienta pro účinnost a úspěšnost léčby. Míra toxicity do jisté míry souvisí s pravděpodobností vzniku sekundární malignity. Konzistentně s tím se v posledních letech ukazuje, že variantní genotyp/fenotyp TPMT je spojen se vznikem sekundárních malignit, včetně mozkových tumorů a akutní myeloidní leukémie u pacientů s vyléčenou akutní lymfoblastickou leukémií. Vyšetření TPMT před podáním thiopurinů léčiv patří mezi doporučovanou součást farmakogenetického algoritmu pro individualizaci dávek léčiva.

Polymorfizmus genu TPMT pro výše zmíněné nejčastější deficitní alely byl stanoven u 50 dětských pacientů s ALL. Vzorky DNA byly izolovány z leukocytů periferní krve systémem MagNA Pure (Roche), který využívá technologii izolace DNA pomocí magnetických kuliček. Pro molekulárně genetickou analýzu byly navrženy specifické hybridizační sondy pro jednotlivé deficitní alely a optimalizovány podmínky real-time PCR. Na základě analýzy křivek teploty tání hybridizačních sond LightSNiP (TibMolBiol) na přístroji LightCycler 480 (Roche) byly stanoveny genotypy TPMT u pacientů. V námi vyšetřeném souboru pacientů byly zastoupeny následující genotypy TPMT*1/*1 (wildtype) (89,8 %), TPMT*2/*1 (2,0 %) a TPMT*3A/*1, resp. TPMT*3B/*3C, (8,2 %), genotypy TPMT*3B/*1 a TPMT*3C/*1 nebyly v našem souboru zachyceny.

Aktivita enzymu TPMT je u pacientů sledována na základě měření aktivity v erytrocytech pomocí kinetické HPLC. U vyšetřených pacientů byly zjištěny jak individuální rozdíly v aktivitě TPMT, tak významné rozdíly v závislosti na genotypu TPMT, kdy jedinci nesoucí mutantní alelu vykazovali sníženou aktivitu enzymu.

Komplexní farmakogenetické vyšetření TPMT s individuální interpretací výsledku bylo provedeno u 42 pacientů s ALL. Postup se v dosavadní praxi jeví jako proveditelný a dle našeho názoru poskytuje ojedinělé korelativní informace genotypu a farmakofenotypu pro konkrétního vyšetřovaného jedince.

Práce byla podpořena výzkumným záměrem FUNDIN MZMOU2005.