Konference: 2006 2. ročník Dny diagnostické, prediktivní a experimentální onkologie
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: Postery
Číslo abstraktu: 001p
Autoři: M. Prchalová; E. Buršíková; MUDr. Petra Kleiblová, Ph.D.; E. Scholzová; RNDr. Eva Matoušková, CSc.; Prof. MUDr. Zdeněk Kleibl, Ph.D.
EM-G3 je nová klonální linie nádorových
progenitorů lidského mamárního karcinomu se zachovalou schopností
diferenciace v myším modelu. Cílem práce bylo hodnocení exprese
genů angažovaných v estrogenní signalizaci mamárních nádorových
buněk v prostředí s estradiolem (E2) a tamoxifenem (TAM) ve
srovnání s estrogen-dependentní linií MCF7.
Metody: Stanovení růstových charakteristik linie EM-G3 v různých koncentracích TAM (antagonisty estrogenního receptoru – ER) a E2 (agonisty ER) bylo provedeno za účelem zjištění závislosti EM-G3 buněk na přítomnost regulátorů ER v médiu. Růstové parametry byly stanoveny pomocí kolorimetrické analýzy koncentrace proteinů, tzv. sulforhodaminovým testem. Na základě těchto výsledků byla vybrána nejvhodnější/nejúčinnější koncentrace estradiolu (10-7 M) a tamoxifenu (10-6 M). Těmto koncentracím byly vystaveny EM-G3 buňky stejně jako kontrolní ER pozitivní buňky MCF7 po dobu 16 h a 40 h. Následné vyšetření genové exprese proběhlo pomocí dvou cDNA arrayů „Breast Cancer & Estrogen Receptor Signaling“ a „Cancer PathwayFinder“ (Superarray). Detailnější analýza genů pro ERα, BRCA1, BRCA2 a pS2 (TFF1), což je kódující polypeptid sekretovaný mamárními buňkami stimulovaný estrogenem, byla provedena pomocí kvantitativní real-time PCR (qPCR) se SYBRGreen I (Roche).
Výsledky: Výsledky stanovení růstových charakteristik vypovídají o insenzitivitě buněk EM-G3 na přítomnost E2 (podobně jako je tomu u E2 rezistentní linie MDA-MB231). Pomocí cDNA arraye bylo vyšetřeno celkem 170 genů (22 genů bylo společných pro oba typy arraye). Buněčná linie MCF7 exprimovala 62 genů, buňky EM-G3 linie 55 genů. V buňkách estrogen-dependentní linie MCF7 kultivovaných v přítomnosti E2 (16h a/nebo 40h) byla, ve srovnání s kontrolou bez přítomnosti aktivní substance, exprese snížena u 37 genů (např. Apaf-1, Bcl2-L1, CD44, ITGB1, MDM2, PTEN) a zvýšena u 19 genů (např. CDH1, CYP19A1, ErbB2, Muc-18, pS2, PAI-1). Přítomnost TAM způsobovala v buňkách MCF7 snížení exprese u 26 genů (např. CCNE2, PIK3CB, pS2, Raf1) a zvýšení u 15 genů (např. Apaf-1, Bcl2-L1, ERβ, MDM2). Přítomnost aktivních substancí ovlivňovala transkriptom kultivovaných EM-G3 buněk velmi málo: vlivem E2 došlo ke snížení exprese EGFR, ErbB2, PTEN, PAI-1 a zvýšení exprese F3, ITGA6, Muc-18, NME4, maspin. Ještě menší změny byly vyvolány TAM (snížení exprese CD44, PIK3CB a PAI-1; zvýšení exprese ITGA6, Muc-18 a NME4).
Exprese genu pS2 pomocí qPCR vykazovala u linie MCF7 signifikantní změny v závislosti na přítomnosti E2 (zvýšení exprese o 60 %) a TAM (snížení exprese o 65 %). Linie EM-G3, stejně jako linie MDA-MB231, vykazovala nízkou expresi pS2, jejíž míra nebyla ovlivněna přítomností TAM nebo E2. Exprese ERα, BRCA1, BRCA2 v buňkách EM-G3 je nízká a neovlivněná E2 ani TAM.
Závěr: Expresní analýza buněčné linie EM-G3 ukázala, že se jedná o populaci E2 insenzitivních buněk s nízkou expresí ERα a ERβ. Tato charakteristika společně s expresí markerů nezralých buněk epitelu prsní žlázy (ITGA6+, CD44+, K18-, K19-, pS2-) podporuje, vedle předchozích imunocytochemických vyšetření a zachovalé částečné schopnosti diferenciace, předpoklad o původu EM-G3 buněk z imortalizovaných nádorových progenitorů s neúplnou nádorovou transformací.
Poděkování: Práce byla podpořena grantem č. 93/2005/C/FaF GAUK.
Metody: Stanovení růstových charakteristik linie EM-G3 v různých koncentracích TAM (antagonisty estrogenního receptoru – ER) a E2 (agonisty ER) bylo provedeno za účelem zjištění závislosti EM-G3 buněk na přítomnost regulátorů ER v médiu. Růstové parametry byly stanoveny pomocí kolorimetrické analýzy koncentrace proteinů, tzv. sulforhodaminovým testem. Na základě těchto výsledků byla vybrána nejvhodnější/nejúčinnější koncentrace estradiolu (10-7 M) a tamoxifenu (10-6 M). Těmto koncentracím byly vystaveny EM-G3 buňky stejně jako kontrolní ER pozitivní buňky MCF7 po dobu 16 h a 40 h. Následné vyšetření genové exprese proběhlo pomocí dvou cDNA arrayů „Breast Cancer & Estrogen Receptor Signaling“ a „Cancer PathwayFinder“ (Superarray). Detailnější analýza genů pro ERα, BRCA1, BRCA2 a pS2 (TFF1), což je kódující polypeptid sekretovaný mamárními buňkami stimulovaný estrogenem, byla provedena pomocí kvantitativní real-time PCR (qPCR) se SYBRGreen I (Roche).
Výsledky: Výsledky stanovení růstových charakteristik vypovídají o insenzitivitě buněk EM-G3 na přítomnost E2 (podobně jako je tomu u E2 rezistentní linie MDA-MB231). Pomocí cDNA arraye bylo vyšetřeno celkem 170 genů (22 genů bylo společných pro oba typy arraye). Buněčná linie MCF7 exprimovala 62 genů, buňky EM-G3 linie 55 genů. V buňkách estrogen-dependentní linie MCF7 kultivovaných v přítomnosti E2 (16h a/nebo 40h) byla, ve srovnání s kontrolou bez přítomnosti aktivní substance, exprese snížena u 37 genů (např. Apaf-1, Bcl2-L1, CD44, ITGB1, MDM2, PTEN) a zvýšena u 19 genů (např. CDH1, CYP19A1, ErbB2, Muc-18, pS2, PAI-1). Přítomnost TAM způsobovala v buňkách MCF7 snížení exprese u 26 genů (např. CCNE2, PIK3CB, pS2, Raf1) a zvýšení u 15 genů (např. Apaf-1, Bcl2-L1, ERβ, MDM2). Přítomnost aktivních substancí ovlivňovala transkriptom kultivovaných EM-G3 buněk velmi málo: vlivem E2 došlo ke snížení exprese EGFR, ErbB2, PTEN, PAI-1 a zvýšení exprese F3, ITGA6, Muc-18, NME4, maspin. Ještě menší změny byly vyvolány TAM (snížení exprese CD44, PIK3CB a PAI-1; zvýšení exprese ITGA6, Muc-18 a NME4).
Exprese genu pS2 pomocí qPCR vykazovala u linie MCF7 signifikantní změny v závislosti na přítomnosti E2 (zvýšení exprese o 60 %) a TAM (snížení exprese o 65 %). Linie EM-G3, stejně jako linie MDA-MB231, vykazovala nízkou expresi pS2, jejíž míra nebyla ovlivněna přítomností TAM nebo E2. Exprese ERα, BRCA1, BRCA2 v buňkách EM-G3 je nízká a neovlivněná E2 ani TAM.
Závěr: Expresní analýza buněčné linie EM-G3 ukázala, že se jedná o populaci E2 insenzitivních buněk s nízkou expresí ERα a ERβ. Tato charakteristika společně s expresí markerů nezralých buněk epitelu prsní žlázy (ITGA6+, CD44+, K18-, K19-, pS2-) podporuje, vedle předchozích imunocytochemických vyšetření a zachovalé částečné schopnosti diferenciace, předpoklad o původu EM-G3 buněk z imortalizovaných nádorových progenitorů s neúplnou nádorovou transformací.
Poděkování: Práce byla podpořena grantem č. 93/2005/C/FaF GAUK.
Datum přednesení příspěvku: 7. 12. 2006
