Expresní analýza genů zapojených v patogenezi rabdomyosarkomů

Rabdomyosarkomy jsou nejčastějšími nádory měkkých tkání dětského věku. Rabdomyosarkomy dětského věku se vyskytují ve dvou základních variantách: alveolární (aRMS) a embryonální (eRMS).

V rámci studie jsme provedli absolutní kvantifikaci fúzních genů (PAX3-FKHR a PAX7-FKHR) a genů zapojených do patogeneze RMS (MyoD1, Myogenin, Igf2, Egfr a telomerázové katalytické podjednotky hTERT). Vyšetřili jsme 118 pacientů s diagnózou RMS a kontrolní skupinu vzorků. Detekce fúzních genů vyvolaných translokací představují vhodný marker pro sledování minimální diseminované nemoci, popř. okrajů excize u pacientů s fúzně pozitivním aRMS.

Sledovali jsme roli imprintovaného genu Igf2 v patogenezi RMS. Zjistili jsme, že exprese genu Igf2 hraje roli v patogenezi RMS. Hladina mRNA Igf2 byla u R MS signifikantně vyšší než u kontrolní skupiny (p=0.0001). Nepozorovali jsme rozdíl v hladině exprese Igf2 mezi eRMS a aRMS.

Zjistili jsme stonásobně vyšší hladinu Igf2 mRNA u RMS oproti zdravé svalové tkání. Zjistili jsme vysokou hladinu Igf2 mRNA u RMS v korelaci s hladinou mRNA pro MyoD1a pro Myogenin. Tento nález je pravděpodobně způsoben tím, že MyoD1 a následně i Myogenin jsou cílovými geny IG F2 dráhy, a to jak u aRMS, tak i eRMS.

Dále jsme se zaměřili na sledování hladin exprese genů pro receptor pro epidermální růstový faktor EGFR a dále pak pro katalytickou podjednotku telomerázy hTERT.

V normálních somatických buňkách se telomery zkracují během života buňky při každé replikaci a telomeráza není v těchto buňkách detekovatelná. V kontrastu s tím mají germinální a fetální buňky vysokou telomerázovou aktivitu a telomera si zachovává svoji délku nezávisle na počtu dělení. Aktivita telomerázy – enzymu, který prodlužuje telomery, je zodpovědná za imortalizaci buněk během embryonálního vývoje, za imortalizaci kmenových buněk, buněk reprodukčních orgánů, ale zároveň i buněk nádorových. Telomeráza jako enzym se skládá ze 3 základních komponent: komponenta RNA polymerázy (hTERC), s telomerázou asociovaný protein (TEP1) a telomerázová katalytická podjednotka (hTERT).

V naší studii jsme se zaměřili na sledování aktivity telomerázy u pacientů s R MS, proto jsme aplikovali relativní kvantifikaci pomocí RQ-RT-PCR katalytické podjednotky hTER T u 93 vzorků RMS (49 alveolárních a 44 embryonálních RMS). Výsledky jsme srovnávali s kontrolními skupinami jiných mesenchymalních nádorů, dále pak s nádory mléčné žlázy, non-Hodgkinskými lymfomy a neposledně se zdravou svalovou tkání.

Hladina mRNA hTERT byla u rabdomyosarkomů signifikantně vyšší než u kontrolní skupiny (p=0.0001). Dále jsme pozorovali signifikantní rozdíl v hladině exprese hTERT mezi oběma skupinami RMS – vyšší hladina byla detekována u alveolární varianty; u embryonální varianty byla hladina hTERT mRNA nižší. Hladina mRNA hTERT nekorelovala s věkem nemocných, s jejich pohlavím ani s přežitím pacientů.

Receptor epidermálního růstoveho faktoru (EGFR) je transmembránový receptor, který ovlivňuje buněčnou proliferaci a růst. Navázánim aktivujících ligandů (EGF) na extracelulární doménu receptoru indukuje homo- či heterodimerizaci receptoru, následnou autofosforylaci a aktivaci signální dráhy. Deregulace EGFR je popisována především u epiteliálních tumorů, což z něj činí dobrý cíl pro protinádorovou terapii. V současné době jsou k dispozici dva druhy terapie cílené na EGFR. Jednak tyrosinkinázové inhibitory zabraňující fosforylaci intracelulární katalytické domény EGFR, mezi něž patří gefitinib a erlotinib používáme zejména v terapii plicních karcinomů, jednak anti-EG FR monoklonálni protilátky jako cetuximab a panitumumab, které se váží na extracelulární doménu EGFR, a zabraňují tak vazbě ligandu. Vyšetření hladiny exprese, popř. amplifikace genu EGFR může posloužit k odhadu úspěšnosti léčby pomocí výše zmíněných inhibitorů EGFR.

Hladina mRNA EGFR byla u rabdomyosarkomů signifikantně vyšší než u kontrolní skupiny (p=0.0001). Dále jsme pozorovali signifikantní rozdíl v hladině exprese EGFR mezi oběma skupinami RMS – vyšší hladina byla detekována u embryonální varianty. Podobný obraz jsme pozorovali při imunohistochemickém barveni receptoru EGFR, kdy u eRMS dominovala silná difúzní pozitivita, na rozdíl od aRMS, kde přes pozitivitu mRNA EGFR jsme zvláště u fúzně pozitivních pacientů pozorovali negativní výsledky imunohistochemického barvení. Hladina mRNA EGFR nekorelovala s věkem nemocných, s jejich pohlavím, ani s generalizací nádoru v době diagnózy, či lokalizaci primárního nádoru. Signifikantní rozdíl vyšší hladiny mRNA pro EGFR jsme zaznamenali v souvislosti s přežitím pacientů a s přežitím pacientů bez známek onemocnění, což dáváme do souvislosti s obecně lepší prognózou pacientů s eRMS a jejich delším obdobím bez známek nemoci.

Z dosažených výsledků sledování exprese genu EGFR je patrné, že u případů, kde je detekována silná pozitivita imunohistochemického barvení EGFR, lze této vlastnosti nádorových buněk využít k terapii pomocí výše zmíněných inhibitorů EGFR, zvlaště pak u pacientů, u kterých došlo k selháni léčby.

Podpořeno projektem (Ministerstva zdravotnictvi) koncepčniho rozvoje vyzkumne organizace 00064203 (FN MOTOL).