Exprese matrixových metaloproteináz 2 a 7 (MMP-2, MMP-7) a tkáňového inhibitoru matrixových metaloproteináz 1 a 2 (TIMP-1, TIMP-2) u kolorektálního karcinomu měřená kvantitativní RT-PCR

Úvod
Kolorektální karcinom je v České republice druhým nejčastějším karcinomem u mužů a žen. Všechny karcinomy tlustého střeva postupně prorůstají střevní stěnou do okolních struktur a infiltrují lymfatické a krevní cévy. Nezbytným krokem nádorové invazivity a metastazování je degradace extracelulární matrix (ECM) a prostup bazální membránou (BM). Matrixové metaloproteinázy (MMPs) a jejich inhibitory, inhibitory matrixových metaloproteináz (TIMPs), hrají důležitou roli v procesu degradace ECM a BM ve vztahu k nádorové invazivitě [1,2]. MMP-2 (92kDa typ kolagenázy IV) degraduje molekuly kolagenu IV, který je hlavní komponentou BM [3]. MMP-7 (Matrilysin) je enzym degradující molekuly fibronektinu, elastinu a lamininu. Aktivita matrixových metaloproteináz závisí na rovnováze mezi hladinou aktivního enzymu a tkáň ového inhibitoru matrixových metaloproteináz. TIMP-2 se váže specificky nekovalentní vazbou na pro-formu MMP-2 a inhibuje jeho enzymatickou aktivitu [4]. TIMP-1 reguluje aktivitu MMP-7. Záměrem naší studie bylo stanovení exprese MMP-2, MMP-7. TIMP-2 a TIMP-1 ve tkáňových vzorcích kolorektálního karcinomu metodou real-time PCR a korelovat ji se stadiem choroby.

Pacienti a metody
Do studie bylo zahrnuto 38 pacientů s primárně detegovaným kolorektálním karcinomem (průměrný věk 70 let, rozpětí 33-
89 let). Rozložení stadií dle TNM bylo následující: stadium I (n=2), stadium II (n=14), stadium III (n=11) stadium IV (n=11). Od těchto pacientů jsme získaly tkáň ové vzorky z resekátu nádorové tkáně. Jako kontrolní skupinu jsme použili 30 vzorků tkáně tlustého střeva, z toho 19 vzorků zdravé tkáně (z bezpečnostní zóny mezi resekční linií a operačním resekátem) a 11 vzorků tkáně benigního onemocnění tlustého střeva (ulcerozní kolitida, Crohnova choroba). Všechny vzorky byly po chirurgickém výkonu histologicky verifikovány a zamraženy na –75°C. Ze 100 mg vzorku jsme izolovali celkovou RNA kitem RNAgent Total Isolation System Promega (Promega Corporation, USA). Množství izolované celkové RNA jsme určili spektrofotometricky. 3 µg izolované celkové RNA jsme použili do reverzní transkripce (RT). Reverzní transkripci jsme provedli pomocí enzymu Superscript II Reverse Transcriptase (Life Technologies, USA). Jako primer pro RT jsme použili oligo d(T)21. Primery pro MMP-2, MMP-7. TIMP-2 a TIMP-1 jsme navrhli tak, aby překračovaly minimálně jeden intron. Primery pro GAPDH byly syntetizovány dle jednotného protokolu [5]. Fragmenty získané PCR jsme inzertovali do vektoru pGEM (Promega Corporation, USA), klonovali a sekvenováním ověřili primární strukturu DNA. Klonované fragmenty MMP-2, MMP-7, TIMP-2 TIMP-1 a GAPDH jsme použili jako standardy o známém počtu molekul. 1 µl cDNA každého vzorku jsme použili pro PCR. Real-time PCR jsme provedli na přístroji Rotor-Gene (Corbett Research, Australia). Pro stanovení amplifikace DNA jsme použili barvu SYBR Green I, která se váže ke dvojvláknové molekule DNA. Velikost produktů PCR amplifikace u primerů pro GAPDH byla 226 bp u MMP-2 163 bp, MMP-7 170 bp, TIMP-2 185 bp a TIMP-1 130 bp. Specifitu reakce jsme ověřili pomocí křivky tání a elektroforézy. Stanovení jsme provedli jako absolutní (počet molekul cDNA) a jako standardy jsme použili klonované fragmenty cDNA. U všech vzorků jsme také stanovovali expresi GAPDH (housekeeping gen). Výsledky jsou uváděny jako relativní hodnoty – poměr mezi počtem kopií stanovovaného genu (MMP-2, MMP-7, TIMP-2 nebo TIMP-1) a GAPDH. Pro statistickou analýzu byl použit software S.A.S. (Statistical Analysis Software) a program Statistica. Kromě výpočtu základních statistických údajů byly použity neparametrické testy (Kruskal-Wallisův test a Wilcoxonův test) s ohledem na non-gaussovské rozložení hodnot.

Výsledky
Protože jsme sledované parametry (kromě GAPDH) nedetegovali u všech vzorků v jednotlivých skupinách, zjišťovali jsme testem relativní četnosti, zda přítomnost mRNA MMP-2, MMP-7, TIMP-2 a TIMP-1 není charakteristická pro některou skupinu.
V tabulce č.1 jsou uvedeny četnosti stanoveného parametru mRNA u vzorků nádorové kolorektální tkáně a nenádorové kolorektální tkáně (zdravá tkáň + benigní onemocnění). V tabulce č.2 jsou hodnoty statistické významnosti (p-hodnota). Přítomnost mRNA MMP-2, MMP-7, a TIMP-1 byla nalezena signifikantně vyšší (p<0.003, p<0.0001, p<0.0001) u nádorové tkáně než u nenádorové tkáně. Pokud jsme vyhodnotili přítomnost mRNA TIMP-2 u nádorové tkáně ve srovnání s nenádorovou tkání byla signifikance hraničně významná (p<0.05).
Dále jsme zjišťovali rozdíly v hladině exprese zvolených genů mezi nádorovými vzorky a nenádorovou tkání. Výsledky shrnuje tabulka č. 3. Zjistili jsme signifikantně vyšší expresi MMP-2, MMP-7 a TIMP-1 v nádorové tkáni kolorektálního karcinomu ve srovnání s kontrolní skupinou. U nádorových vzorků střevní tkáně jsme zjišťovali závislost exprese mRNA MMP-2, MMP-7, TIMP-2, TIMP-1 a poměru MMP-2/TIMP-2 na stádiu nádorového onemocnění. Nebyl však zjištěn signifikantní rozdíl mezi jednotlivými stadii I až IV.

Diskuse
Kolorektální karcinom je v civilizovaných zemích nejčastějším karcinomem u mužů po karcinomu plic a u žen po karcinomu prsu. Mortalita spojená s tímto onemocněním je v České republice nejvyšší na světě a to u obou pohlaví. Jednou z příčin tohoto stavu je pozdní diagnostika kolorektálního karcinomu, kdy více než 50% nádorů je diagnostikováno v pozdních stádiích choroby (stadium III a IV) [6]. Tomuto stavu odpovídalo i zastoupení stádií v našem souboru pacientů, kde stadium III a IV bylo zastoupeno v 60% (23 z 38 pacientů).
Stanovení MMP-2, MMP-7, TIMP-2 a TIMP-1 jako proteinů v séru, ve tkáni nebo formou mRNA ve tkáni, v lymfatických uzlinách nebo periferní krvi a jejich korelace se stádiem choroby bylo publikováno v řadě prací, výsledky však nejsou jednoznačné. Námi zjištěná zvýšená exprese mRNA MMP-2, MMP-7 a TIMP-1 v nádorové tkáni je ve shodě se závěry publikací Murashiga a kol., Yoshimoto a kol., Chan a kol. [7,8,9]. Výsledky exprese mRNA TIMP-2 nejsou tak jednoznačné. Zatím co práce Baker a kol. uvádí sníženou hladinu mRNA TIMP-2 v nádorové tkáni Wan a kol. detegovali zvýšenou hladinu mRNA TIMP-2 v nádorové tkáni. Korelace se stádiem onemocnění vypadá podobně.

Závěr
Přítomnost mRNA MMP-2, MMP-7, TIMP-1 a TIMP-2 byla nalezena signifikantně vyšší u nádorové tkáně. Hladina exprese mRNA MMP-7, TIMP-1 a MMP-2 byla signifikantně vyšší v nádorové tkáni kolorektálního karcinomu než v kontrolní tkáni. Neprokázali jsme korelaci mezi expresí těchto genů a stádiem onemocnění.

Literatura

1. 
   
2. Fingleton BM, Heppner Goss KJ, Crawford HC, Matrisian LM. Matrilysin in early stage intestinal tumorigenesis. APMIS
   1999; 107: 102-110
   
3. Stamenkovic I. Matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis. Semin Cancer Biol 2000; 10: 415-433
   
4. Liotta LA, Tryggvason K, Garbisa S, Hart I, Foltz CM, Shafdie S. Metastatic potential correlates with enzymatic degradation of basement membrane collagen. Nature 1980; 284: 67-8
   
5. Goldberg, G.I.,Marmer, G. A. Grant, A. Z. Eisen, S. Wilhelm, and C. S. He. 1989. Human 72-kilodalton type IV collagenase forms a comlpex with a tissue inhibitor of matalloproteases designated TIMP-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8207-8211.
   
6. Corbett research: Protocol for DNA Amplification Detection in Real-Time PCR Using Sybr-green I Intercalating Dye
   
7. Holubec L. sen., Pecen L., Holubec L. jr. Epidemiologie kolorektálního karcinomu. In Kolorektální karcinom: Současné možnosti diagnostiky a léčby. Praha: Grada Publishing, 2004, s. 15-18.
   
8. Murashige M, Miyahara M, Shiraishi N, Saito T, Kohno K, Kobayashi M. Enhanced expression of tissue inhibitors of metalloproteinases in human colorectal tumors. Jpn J Clin Oncol. 1996 Oct; 26(5):303-9.
   
9. Yoshimoto M, Itoh F, Yamamoto H, Hinoda Y, Imai K, Yachi A. Expression of MMP-7(PUMP-1) mRNA in human colorectal cancor. Int J Cancer. 1993 Jun 19;54(4):614-8.
   
10. Chan CC, Menges M, Orchowski HD, Orendain N, Pistorius G, Feifel G, Zeitz M, Stallmach A. Increased matrix metalloproteinase 2 concentration and transcript expression in advanced colorectal carcinoma. Int J Colorectal Dis 2001; 16:133-140.
    
11. Baker EA, Bergin FG, Leaper DJ. Matrix metalloproteinases, their tissue inhibitors and colorectal cancer staging. Br J Surg.
    2000 Sep; 87(9): 1215-21
    
12. Wan Y, Wei Q, Pan Y, Liu Y. Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases in colorectal neoplasm. Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 2000 Jul; 38(7):510-3.