Konference: 2004 XXVIII. Brněnské onkologické dny a XVIII. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Onkologická diagnostika
Téma: Molekulární a laboratorní diagnostika nádorů
Číslo abstraktu: 33
Autoři: MUDr. Monika Černá; Doc. MUDr. Luboš Holubec (jr.), Ph.D., MBA; RNDr. Martin Pešta, Ph.D.; Prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc.; R. Černý
Úvod
Zhoubné nádory jsou nejčastějším genetickým onemocněním člověka. Postupná kumulace mutací vede k ovlivnění genové exprese, změně regulace buněčného cyklu a ke změněnému chování buňky. Je proto logické, že kromě detekce vlastních mutací, je možné se orientovat v biologických vlastnostech nádorů prostřednictvím měření exprese vybraných genů. Je ovšem otázkou, které geny to mají být. V naší studii jsme v první fázi zvolili geny, produkující známé tumorové markery, a to karcinoembryonální antigen (CEA), cytokeratin 20 (CK20) a vaskulární endotheliální růstový faktor A (VEGF). Jako referenční gen byla vybrána glyceraldehydfosfátdehydrogenasa (GAPDH), glykolytický enzym.
Pacienti a metody
Tato studie zahrnuje 16 vzorků benigních střevních a jaterních lézí, 12 vzorků sliznice tlustého střeva z okrajů resekátu, 85 vzorků kolorektálního adenokarcinomu, 35 vzorků jaterních metastáz kolorektálního karcinomu a 18 vzorků plicního karcinomu. Všichni pacienti byli operováni na chirurgické klinice FN v Plzni v letech 1998 – 2003. Vzorky tkání byly během operace zamraženy na –75°C a skladovány při této teplotě až do použití.
Celková RNA byla isolována z 50-100 mg tkáně a 3 µg RNA byly použity pro reverzní transkripci (Superscript II, Life Technologies), primer byl oligo-d(T)21. 1 µl reverzního transkriptu (odpovídající 150 ng celkové RNA) bylo použito pro jednotlivá stanovení pomocí kvantitativní PCR (přístroj Rotor-Gene 2000, celkový objem 20 µl, 0,5x Sybr-Green I). Všechny primery byly vybrány tak, aby překračovaly minimálně jeden intron. Standardy pro kvantifikaci byly připraveny z PCR amplionů, které byly klonovány v pGEM-T plasmidu, nukleotidová sekvence byla ověřena sekvenováním (přístroj ALFexpress, Pharmacia Biotech), a po linearizaci byly standardy zředěny v rozsahu 103 – 108 kopií na µl. Výsledky jsou uváděny jednak jako absolutní (počet kopií specifické mRNA na 150 ng celkové RNA) jednak jako relativní (poměr příslušné mRNA a mRNA pro GAPDH).
Pro statistickou analýzu byl použit software S.A.S. (Statistical Analysis Software) a program Statistica. Kromě výpočtu základních statistických údajů byly aplikovány neparametrické testy (Kruskal-Wallisův test a Wilcoxonův test) s ohledem na negaussovské rozložení hodnot a pro zjištění závislostí ve skupinách byl použit Spearmanův koeficient korelace.
Výsledky
Dvě použité skupiny kontrolních vzorků (benigní léze a sliznice z okrajů resekátů) byly analyzovány ve všech parametrech
(GAPDH, CEA, CK20, VEGF) a nebyly zjištěny signifikantní rozdíly v žádném z nich, a to jak v hodnotách absolutních, tak relativních. Proto byly obě skupiny spojeny a použity jako kontrolní skupina vůči jednotlivým nádorům.
Celkový přehled dosažených výsledků představuje Tabulka 1. Přestože dvojí a trojí stanovení počtu mRNA kopií v jednolivých vzorcích vykazovalo velmi dobrou reprodukovatelnost, při hodnocení celých skupin konstatujeme negaussovské rozložení hodnot, jejich značný rozptyl, a proto volíme prezentaci v podobě mezikvartilového rozpětí. Rozhodující je ovšem statistická významnost rozdílů mezi skupinami (p-hodnota), která ukazuje na průkazné rozdíly mezi expresí jednotlivých genů v nádorech a v kontrolách. Vzhledem k tomu, že byly zvoleny geny, které zvyšují expresi především u kolorektálního karcinomu, je pochopitelné, že jejich exprese v plicním karcinomu není přesvědčivě zvýšena (CK20 a překvapivě i VEGF). Rozdíly v expresi zvolených genů mezi jednotlivými tumory shrnuje Tabulka 2. Nejvíce rozdílů je mezi kolorektálním karcinomem a karcinom plic, nejmenší mezi kolorektálním karcinomem a jeho metastázami v játrech. Za pozornost stojí i fakt, že exprese GAPDH, která je tradičně užívána jako „house-keeping gene“ a která představuje standardní úroveň genové exprese, má rovněž rozdílné absolutní hodnoty u nádorů a u kontrol. Není to nijak mimořádně překvapivé, protože GAPDH je glykolytický enzym a glykolýza bývá stimulována u nádorů všeobecně (ostatně jako celý metabolismus).
Byly rovněž zjišťovány vzájemné korelace v expresi sledovaných hodnot v rámci jednotlivých skupin a jejich přehled podává Tabulka 3. Korelace mezi CEA a CK20 není překvapivá, zajímavá je ale u GAPDH a VEGF, neboť se vyskytuje i v kontrolní skupině. Můžeme to vysvětlit jako vzájemnou korelaci „normálních“ genových produktů.
Zjištěné hladiny jednotlivých mRNA byly také konfrontovány s dostupnými sérovými hladinami různých markerů zjištěných ke dni operace (Tabulka 4). Hlavním nálezem v tomto směru je nepřítomnost korelace mezi hladinou mRNA pro CEA v tkáni a hladinou CEA v séru, a to jak u absolutních, tak relativních hodnot. Nejlepší korelace vůbec byla naopak zjištěna mezi hladinou mRNA pro VEGF u jaterních metastáz a sérovou thymidinkinasou (TK) a dále sérovým TPA. Mezi kolorektálními karcinomy naopak nejlépe koreluje absolutní hodnota CEA v nádoru se sérovým TPS.
Naše výsledky byly také porovnány s histologickými nálezy. Naprostá většina kolorektálních karcinomů byla histologicky hodnocena jako adenokarcinom (8140/3) nebo tabulární adenokarcinom (8211/3). Statistické zhodnocení výsledků exprese zvolených genů neukázalo žádný průkazný rozdíl mezi těmito dvěma skupinami. Vedle toho bylo provedeno i srovnání se stupněm histologické zralosti tumoru (grading) a positivní výsledky zjištěné Kruskal-Wallisovým testem byly dále upřesněny mezi dvojicemi skupin Wilcoxonovým testem a výsledky jsou předloženy v Tabulce 5. Výsledky prokazují vyšší expresi GAPDH a CK20 u histologicky zralejších typů, zatímco exprese VEGF se stupněm zralosti tumoru klesá. Hodnoty exprese CEA se rovněž zvyšují se stupněm zralosti karcinomu, hodnoty však postrádají statistickou průkaznost.
Pokud jde o expresi zvolených genů a stadia nádorového onemocnění, rozdělili jsme sledované pacienty dle TMN klasifikace na dvě skupiny, z nichž první zahrnovala stadia I+II, druhá pak stadia III+IV. V rámci sledovaných parametrů nebyl zjištěn signifikantní rozdíl mezi těmito dvěma skupinami.
Diskuse
Exprese zvolených genů byla v četných publikacích mnohokrát sledována, především formou stanovení příslušných proteinů v séru, ale i formou stanovení mRNA v lymfatických uzlinách nebo v portální či periferní krvi. Výsledky těchto prací představují široké spektrum úspěšnosti v predikci vývoje onemocnění, a to od velmi optimistických, až po kritická hodnocení v poslední době (1-3). Je ale relativně málo prací, které se zabývají expresí těchto genů v primární nádorové tkáni, a proto i výsledky této naší práce mají své opodstatnění. Pokud jde o expresi CEA v tumoru, je u naší skupiny kolorektálních karcinomů prakticky úplná, což kontrastuje se známou praxí, pokud jde o zvýšené hodnoty CEA v séru (včetně našich pacientů). Tento fakt je jistě také hlavním důvodem proč nenacházíme positivní korelaci mezi hladinou exprese CEA v nádoru a hladinou CEA v séru. Ostatně již Jothy a spol.(4) detailně studovali expresi CEA v normální a nádorové tkáni a kromě jiného rozlišili secernovaný CEA a vázaný CEA, přičemž se domnívají, že secernovaný CEA inhibuje buněčnou adhesi zprostředkovanou vázaným CEA. Znamená to, že exprese CEA v tkáni není zdaleka identická s množstvím cirkulujícího CEA v krvi a biologická úloha obou těchto forem není zcela vyjasněna.
Nález positivní korelace mezi genovou expresí a histologickou zralostí je jistě zajímavý a snad i významný. Vyšší exprese CK20 a CEA u zralejších forem je v souladu s představou, že tyto specifické produkty tvoří epitelové buňky až na jistém stupni diferenciace. Naproti tomu VEGF je ve vyšší míře tvořeno v méně diferencované tkáni, což jistě souvisí s větší tendencí k růstu nádoru.
Zvolené geny nevykázaly rozdílnou expresi v rámci časných a pozdních stadií nádorového onemocnění, alespoň na úrovni dvou uvedených skupin. Hodnoty genové exprese budou konfrontovány ještě s dalšími parametry sledování pacientů, přičemž není vyloučeno, že k lepším prediktivním výsledkům bude třeba stanovit expresi ještě dalších genů. Ostatně ani daleko rozsáhlejší studie využívající simultánní detekci tisíců mRNA pomocí cDNA mikročipů zatím neposkytly jednoznačné řešení této otázky.
Závěr
Exprese GAPDH, CEA, CK20 a VEGF je signifikantně vyšší v nádorové tkáni a jsou patrné rozdíly mezi jednotlivými typy nádorů. Exprese CK20 a VEGF koreluje se stupněm diferenciace nádoru. Zatím jsme neprokázali korelaci mezi expresí těchto genů a stadiem onemocnění.
Literatura
Zhoubné nádory jsou nejčastějším genetickým onemocněním člověka. Postupná kumulace mutací vede k ovlivnění genové exprese, změně regulace buněčného cyklu a ke změněnému chování buňky. Je proto logické, že kromě detekce vlastních mutací, je možné se orientovat v biologických vlastnostech nádorů prostřednictvím měření exprese vybraných genů. Je ovšem otázkou, které geny to mají být. V naší studii jsme v první fázi zvolili geny, produkující známé tumorové markery, a to karcinoembryonální antigen (CEA), cytokeratin 20 (CK20) a vaskulární endotheliální růstový faktor A (VEGF). Jako referenční gen byla vybrána glyceraldehydfosfátdehydrogenasa (GAPDH), glykolytický enzym.
Pacienti a metody
Tato studie zahrnuje 16 vzorků benigních střevních a jaterních lézí, 12 vzorků sliznice tlustého střeva z okrajů resekátu, 85 vzorků kolorektálního adenokarcinomu, 35 vzorků jaterních metastáz kolorektálního karcinomu a 18 vzorků plicního karcinomu. Všichni pacienti byli operováni na chirurgické klinice FN v Plzni v letech 1998 – 2003. Vzorky tkání byly během operace zamraženy na –75°C a skladovány při této teplotě až do použití.
Celková RNA byla isolována z 50-100 mg tkáně a 3 µg RNA byly použity pro reverzní transkripci (Superscript II, Life Technologies), primer byl oligo-d(T)21. 1 µl reverzního transkriptu (odpovídající 150 ng celkové RNA) bylo použito pro jednotlivá stanovení pomocí kvantitativní PCR (přístroj Rotor-Gene 2000, celkový objem 20 µl, 0,5x Sybr-Green I). Všechny primery byly vybrány tak, aby překračovaly minimálně jeden intron. Standardy pro kvantifikaci byly připraveny z PCR amplionů, které byly klonovány v pGEM-T plasmidu, nukleotidová sekvence byla ověřena sekvenováním (přístroj ALFexpress, Pharmacia Biotech), a po linearizaci byly standardy zředěny v rozsahu 103 – 108 kopií na µl. Výsledky jsou uváděny jednak jako absolutní (počet kopií specifické mRNA na 150 ng celkové RNA) jednak jako relativní (poměr příslušné mRNA a mRNA pro GAPDH).
Pro statistickou analýzu byl použit software S.A.S. (Statistical Analysis Software) a program Statistica. Kromě výpočtu základních statistických údajů byly aplikovány neparametrické testy (Kruskal-Wallisův test a Wilcoxonův test) s ohledem na negaussovské rozložení hodnot a pro zjištění závislostí ve skupinách byl použit Spearmanův koeficient korelace.
Výsledky
Dvě použité skupiny kontrolních vzorků (benigní léze a sliznice z okrajů resekátů) byly analyzovány ve všech parametrech
(GAPDH, CEA, CK20, VEGF) a nebyly zjištěny signifikantní rozdíly v žádném z nich, a to jak v hodnotách absolutních, tak relativních. Proto byly obě skupiny spojeny a použity jako kontrolní skupina vůči jednotlivým nádorům.
Celkový přehled dosažených výsledků představuje Tabulka 1. Přestože dvojí a trojí stanovení počtu mRNA kopií v jednolivých vzorcích vykazovalo velmi dobrou reprodukovatelnost, při hodnocení celých skupin konstatujeme negaussovské rozložení hodnot, jejich značný rozptyl, a proto volíme prezentaci v podobě mezikvartilového rozpětí. Rozhodující je ovšem statistická významnost rozdílů mezi skupinami (p-hodnota), která ukazuje na průkazné rozdíly mezi expresí jednotlivých genů v nádorech a v kontrolách. Vzhledem k tomu, že byly zvoleny geny, které zvyšují expresi především u kolorektálního karcinomu, je pochopitelné, že jejich exprese v plicním karcinomu není přesvědčivě zvýšena (CK20 a překvapivě i VEGF). Rozdíly v expresi zvolených genů mezi jednotlivými tumory shrnuje Tabulka 2. Nejvíce rozdílů je mezi kolorektálním karcinomem a karcinom plic, nejmenší mezi kolorektálním karcinomem a jeho metastázami v játrech. Za pozornost stojí i fakt, že exprese GAPDH, která je tradičně užívána jako „house-keeping gene“ a která představuje standardní úroveň genové exprese, má rovněž rozdílné absolutní hodnoty u nádorů a u kontrol. Není to nijak mimořádně překvapivé, protože GAPDH je glykolytický enzym a glykolýza bývá stimulována u nádorů všeobecně (ostatně jako celý metabolismus).
Byly rovněž zjišťovány vzájemné korelace v expresi sledovaných hodnot v rámci jednotlivých skupin a jejich přehled podává Tabulka 3. Korelace mezi CEA a CK20 není překvapivá, zajímavá je ale u GAPDH a VEGF, neboť se vyskytuje i v kontrolní skupině. Můžeme to vysvětlit jako vzájemnou korelaci „normálních“ genových produktů.
Zjištěné hladiny jednotlivých mRNA byly také konfrontovány s dostupnými sérovými hladinami různých markerů zjištěných ke dni operace (Tabulka 4). Hlavním nálezem v tomto směru je nepřítomnost korelace mezi hladinou mRNA pro CEA v tkáni a hladinou CEA v séru, a to jak u absolutních, tak relativních hodnot. Nejlepší korelace vůbec byla naopak zjištěna mezi hladinou mRNA pro VEGF u jaterních metastáz a sérovou thymidinkinasou (TK) a dále sérovým TPA. Mezi kolorektálními karcinomy naopak nejlépe koreluje absolutní hodnota CEA v nádoru se sérovým TPS.
Naše výsledky byly také porovnány s histologickými nálezy. Naprostá většina kolorektálních karcinomů byla histologicky hodnocena jako adenokarcinom (8140/3) nebo tabulární adenokarcinom (8211/3). Statistické zhodnocení výsledků exprese zvolených genů neukázalo žádný průkazný rozdíl mezi těmito dvěma skupinami. Vedle toho bylo provedeno i srovnání se stupněm histologické zralosti tumoru (grading) a positivní výsledky zjištěné Kruskal-Wallisovým testem byly dále upřesněny mezi dvojicemi skupin Wilcoxonovým testem a výsledky jsou předloženy v Tabulce 5. Výsledky prokazují vyšší expresi GAPDH a CK20 u histologicky zralejších typů, zatímco exprese VEGF se stupněm zralosti tumoru klesá. Hodnoty exprese CEA se rovněž zvyšují se stupněm zralosti karcinomu, hodnoty však postrádají statistickou průkaznost.
Pokud jde o expresi zvolených genů a stadia nádorového onemocnění, rozdělili jsme sledované pacienty dle TMN klasifikace na dvě skupiny, z nichž první zahrnovala stadia I+II, druhá pak stadia III+IV. V rámci sledovaných parametrů nebyl zjištěn signifikantní rozdíl mezi těmito dvěma skupinami.
Diskuse
Exprese zvolených genů byla v četných publikacích mnohokrát sledována, především formou stanovení příslušných proteinů v séru, ale i formou stanovení mRNA v lymfatických uzlinách nebo v portální či periferní krvi. Výsledky těchto prací představují široké spektrum úspěšnosti v predikci vývoje onemocnění, a to od velmi optimistických, až po kritická hodnocení v poslední době (1-3). Je ale relativně málo prací, které se zabývají expresí těchto genů v primární nádorové tkáni, a proto i výsledky této naší práce mají své opodstatnění. Pokud jde o expresi CEA v tumoru, je u naší skupiny kolorektálních karcinomů prakticky úplná, což kontrastuje se známou praxí, pokud jde o zvýšené hodnoty CEA v séru (včetně našich pacientů). Tento fakt je jistě také hlavním důvodem proč nenacházíme positivní korelaci mezi hladinou exprese CEA v nádoru a hladinou CEA v séru. Ostatně již Jothy a spol.(4) detailně studovali expresi CEA v normální a nádorové tkáni a kromě jiného rozlišili secernovaný CEA a vázaný CEA, přičemž se domnívají, že secernovaný CEA inhibuje buněčnou adhesi zprostředkovanou vázaným CEA. Znamená to, že exprese CEA v tkáni není zdaleka identická s množstvím cirkulujícího CEA v krvi a biologická úloha obou těchto forem není zcela vyjasněna.
Nález positivní korelace mezi genovou expresí a histologickou zralostí je jistě zajímavý a snad i významný. Vyšší exprese CK20 a CEA u zralejších forem je v souladu s představou, že tyto specifické produkty tvoří epitelové buňky až na jistém stupni diferenciace. Naproti tomu VEGF je ve vyšší míře tvořeno v méně diferencované tkáni, což jistě souvisí s větší tendencí k růstu nádoru.
Zvolené geny nevykázaly rozdílnou expresi v rámci časných a pozdních stadií nádorového onemocnění, alespoň na úrovni dvou uvedených skupin. Hodnoty genové exprese budou konfrontovány ještě s dalšími parametry sledování pacientů, přičemž není vyloučeno, že k lepším prediktivním výsledkům bude třeba stanovit expresi ještě dalších genů. Ostatně ani daleko rozsáhlejší studie využívající simultánní detekci tisíců mRNA pomocí cDNA mikročipů zatím neposkytly jednoznačné řešení této otázky.
Závěr
Exprese GAPDH, CEA, CK20 a VEGF je signifikantně vyšší v nádorové tkáni a jsou patrné rozdíly mezi jednotlivými typy nádorů. Exprese CK20 a VEGF koreluje se stupněm diferenciace nádoru. Zatím jsme neprokázali korelaci mezi expresí těchto genů a stadiem onemocnění.
Literatura
- Bustin SA, Siddiqi S, Ahmed S, Hands R, Dorudi S: Int J Cancer.
2004, 108: 412-7.
- Akashi A, Komuta K, Haraguchi M, Ueda T, Okudaira S, Furui J,
Kanematsu T: Dis Colon Rektum. 2003, 46: 1653-8.
- Schuster R, Max N, Mann B, Heufelder K, Thilo F, Grone J, Rokos
F, Buhr HJ, Thiel E, Keilholz U: Int J Cancor. 2004, 108:
219-27.
- Jothy S, Juan SY, Sirota K: Am J Pathol. 1993, 143:
250-7.
Datum přednesení příspěvku: 26. 5. 2004
