ELEKTRODOVÉ BIOČIPY NA DETEKCIU DNA Z LUDSKÝCH PAPILOMAVÍRUSOV

Úvod:  

Včasná diagnostika nádorových ochorení vyžaduje vývoj nových metód detekcie nádorových biomarkerov, ktoré by boli predovšetkým rýchle, finančne nenáročné a jednoduché na obsluhu. Medzi takéto metódy patrí i elektrochémia, ktorej ďalšou výhodou je miniaturizovatelnosť elektród a možnosť paralelnej analýzy viacero vzoriek súčasne [1]. V našej práci sme sa zamerali na vývoj elektrochemického testu na detekciu DNA z rizikových kmeňov ľudských papilomavírusov (HPV), najmä HPV 16 a HPV 18, ktorých perzistencia vedie až ku vzniku karcinómu krčka maternice [2].

Materiál a metódy:

DNA bola vyizolovaná z nádorových bunkových línií i zo sterov pacientok pozitívnych aj negatívnych na HPV 16 a HPV 18 a amplifikovaná pomocou PCR. HPV DNA bola detegovaná prostredníctvom hybridizácie s dvoma sondami, a to vazbovej s biotínom, ktorá sa naviazala na streptavidinové magnetické guličky, a detekčnej sondy s digoxigeninom, na ktorú sa naviazala antidigoxigeninová protilátka konjugovaná s peroxidázou. V prítomnosti HPV DNA došlo k naviazaniu navrhnutých sond, a tým aj k prepojeniu guličiek a peroxidázy, ktoré umožňovalo následnú enzymatickú detekciu HPV na uhlíkových čipoch.

Výsledky:

Metóda bola najskôr optimalizovaná hľadaním najvhodnejších parametrov pre hybridizáciu DNA i elektrochemickú detekciu. Optimalizácia metódy viedla k výrazne vyšším signálom u DNA sond v prítomnosti hľadanej HPV než v jej neprítomnosti, a to pre HPV 16 aj HPV 18. Výsledky boli validované na bunkových líniách pozitívnych na HPV 16 (CaSki, SiHa) a HPV 18 (HeLa) i u vzoriek sterov z pacientok pozitívnych na HPV 16. Výsledky dobre korelovali s gélovou elektroforézou.

Záver:

Karcinóm krčka maternice ako jedno z najčastejších malígnych gynekologických ochorení, so štvrtou najvyššou mortalitou u žien, si v súčasnosti vyžaduje predovšetkým včasnú, lacnú a nenáročnú diagnostiku. Preto sme sa rozhodli použiť na detekciu HPV práve elektrochemický test, ktorý sa javí ako úspešná alternativa súčasných metód detekcie. Výsledky dosiahnuté v rámci tejto štúdie potvrdzujú adekvátnosť navrhnutých sond, ich senzitivitu i selektivitu na použitých bunkových líniách karcinómu krčka maternice a taktiež i sterov od pacientok, čo poukazuje na potenciálne využitie tohto testu v dalších štúdiách.

Literatura: [1] Palecek E, Bartosik M. Chem Rev 2012; 112(6): 3427-3481. [2] Steenbergen RD et al. Nat Rev Cancer 2014; 14(6): 395-405.

Práca bola podpořená projektami GAČR 14-24931P, MŠMT- NPUI - LO1413 a MZ ČR - RVO (MOÚ, 00209805).