Elektrochemické studium interkace Doxorubicinu s SS oligonukleotidy.

Klíčová slova: doxorubicin, ssDNA, square-wave voltametrie, diagnostika

   Úvod

   Nádorová onemocnění patří k nejzávažnějším zdravotním problémům 21. století. Karcinom prsu a prostaty je nejčastější příčinou úmrtí pacientů. (Risbridger, et al., Lin, et al.) Léčba nádorů nejčastěji zahrnuje operační zákrok, radioterapii a chemoterapii. Při chemoterapii se nejčastěji používají deriváty platiny a antracyklinová antibiotika nebo jejich kombinace. První antracykliny byly izolovány ze Streptomyces peucetius v šedesátých letech a byly nazvány doxorubicin a hydroxyldaunorubicin (obchodní značka Adriamycin) (Minotti, et al.). Doxorubicin,((8S,10S)-10-(4-amino-5-hydroxy-6-methyl-tetrahydro-2H-pyran-2-yloxy)-6,8,11-trihydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-1-methoxy-7,8,9,10-tetrahydrotetracene-5,12-dione), je znám také pod názvem daunomycin nebo adriamycin, a používá se k léčbě řady nádorů. Účinek tohoto léčiva je komplexní, a předpokládá se, že interguje s DNA interkalačním mechanizmem, kdy dochází k inhibici topoisomerázy (Minotti, et al.).

   Kiyomia et al. (Kiyomiya, et al.) zkoumali biologický účinek doxorubicinu na nádorové a normální buňky. Z výsledků vyplývá, že účinek spočívá v inhibici syntézy DNA pomocí interkalace a akumulace aktivního kyslíku v nádorových buňkách. Jako všechna antracyklinová léčiva má i doxorubicin nežádoucí vedlejší účinky, z nichž nejobávanější je kardiotoxicita. Vedlejší účinky mohou být významně sníženy vytvořením lipozomálního obalu kolem nanočástic léčiva. (Devalapally, et al.)

   Doxorubicin a analogická léčiva obsahují ve své molekule jak chinonové, tak i hydrochinonové skupiny, které skýtají možnost elektrochemické oxidace či redukce. Elektrochemické chování bylo studováno na rtuťových, uhlíkových a různě modifikovaných elektrodách (Riahi, et al.). Na rtuťových elektrodách dochází k redukci chinonové skupiny a karbonylové skupiny na řetězci, což odpovídá dvěma redukčním vlnám. Kromě polarografického studia byla pomocí chronopotenciometrické striping analýzy studována interakce doxorubicinu s DNA. Ke studiu elektrochemického chování doxorubicinu byly rovněž využity elektrody s kombinacemi nanomateriálů. (Vacek, et al., Krizkova, et al.)

   Hlavním cílem této práce bylo zkoumání účinku doxorubicinu na různé sekvence oligonukleotidů (ODN) pomocí square-wave voltametrie (SWV).

   Experimentální část

   Materiál a metody

   Chemikálie a příprava vzorků

   K experimentům byl použit doxorubicin (TEVA, Česká republika). Sekvence single strand oligonkleotidů (ssODN) s označením GL6, GL4, CA3 a MT5 (viz Tabulka 1.), octan sodný, kyselina octová, voda a další chemikálie v ACS kvalitě byly získány od firmy Sigma Aldrich (USA). Každý ODN se skládá z deseti nukleotidů s různou sekvencí bází. Standardní roztoky oligonukleotidů (10 μg/ml) byly připraveny v ACS vodě a skladovány ve tmě při -20°C. Koncentrace oligonukleotidů byla stanovena spektrofotometricky na spektrofotometru Specord 600 (Analytic Jena, Německo) v křemenných kyvetách a termostatovaném sampleru (20 °C). K přípravě všech roztoků byly použity certifikované pipety (Eppendorf, Německo).

Tabulka 1. Použité sekvence ssODN.

Obr. 1. SW voltamogramy (A) GL6, (B) GL4, (C) CA3 a (D) MT5 (0.5 μg/ml) a jejich směs s doxorubicinem (2.5 μg/ml). Doba interakce 90 min. Světlé křivky odpovídají směsi oligonukleotidu s do xorubicinem. Tmavé křivky odpovídají samotnému ssODN oligonukleotidu.

   Elektrochemické stanovení

   K pozorování interakce doxorubicinu s single strand oligonukleotidy (ssODN) bylo využito elektrochemické metody Square-wave voltametrie (SWV). Měření probíhala na přístroji AUTOLAB  PGS30 Analyzer  (EcoChemie, Nizozemí), VA-Stand 663 (Metrohm, Švýcarsko) a 797 VA computrace (Metrohm, Švýcarsko) v klasickém tříelektrodové zapojení. Jako pracovní elektroda byla použita visící rtuťová kapková elektroda (HMDE). Referenční elektroda byla Ag/AgCl/3M KCl a srovnávací Pt elektroda. Pro zpracování dat byl použit software GPES 4.9 (EcoChemie, Nizozemí). Jako pomocný elektrolyt byl použit roztok acetátového pufru pH = 5,0. Parametry SWV: počáteční potenciál 0 V, koncový potenciál -1,8 V, potentciálový krok 5 mV, frekvence 280 Hz, doba akumulace 120 s. Analyzované vzorky byly před měřením probublány argonem (99.999 %) po dobu 120 s. Všechny experimenty probíhaly za pokojové-2,0

   Výsledky a diskuse

   V prvé řadě byl studován vliv koncentrace, doby akumulace a další fyzikálně chemické podmínky chování DNA na elektrodách. Byly použity koncentrace oligonukleotidu (ssODN) od 0,1 do 3,5 μg/ml a doba akumulace 120 s. Redoxní pík cytosinu a adeninu (CA pík) se projeví kolem -1,4 V. Primární sekvence studovaných ssODN (GL6, GL4, CA3, MT5) byla vybrána pro sledování různé polohy adeninu, který je předpokládaným interakčním cílem pro doxorubicin. Získané křivky jsou lineární v rozsahu koncentrací 0,1- 0,75 μg/ml.

   MT5, která má tři adeniny na konci a uprostřed řetězce, dává největší CA pík. CA3 se čtyřmi adeniny ve středu řetězce dává druhý největší CA pík. GL4 a GL6, které mají tři adeniny, vykazují píky stejné intenzity. Z toho vyplývá, že intenzita signálu závisí na počtu adeninů v sekvenci, ale nezávisí na poloze v řetězci. V dalším studiu byl sledován vliv primární struktury studovaných ssODN na potenciál píku. SW voltamogramy GL6, GL4, CA3 a MT5 (0.5 μg/ml) jsou na Obr. 1 A, B, C a D. CA píky při potenciálu -1,4 V se mění po přídavku 2,5 μg/ml doxorubicinu (měřeno po 90 min., 400 otáček, 25 °C). Tyto změny souvisí s interakcí doxorubicinu s ssODN. Dochází k poklesu výšky CA píku a objevuje se pík (DOXO) při potenciálu -0,4 V odpovídající doxorubicinu(Hynek, et al.).

   Závěr

   Elektrochemická analýza se jeví jako vhodná metoda pro studium protinádorového léčiva doxorubicinu s oligonukleotidy (ssODN). Získané výsledky jasně potvrzují interakci doxorubicinu s ssODN. Při této interakci dochází pravděpodobně ke změně distribuce elektronů v molekule DNA a tím ke změnám ve struktuře naměřených voltamogramů. Sekvence použitých ssODN také ovlivňuje naměřený signál a to především mírou a distribucí adeninů v řetězci. Rozdíly v interakci doxorubicinu s různými ssODN naznačují, že cytostatikum může mít relativně selektivní působení na karcinomy se specifickou genetickou změnou. Výsledky budou využity pro cílené specifické působení léčiva na buňky některých nádorů.

Literatura

1. Risbridger, G. P., et al., (2010): Breast and prostate cancer: more similar than different, Nature Reviews Cancer, 10: 205-212.
2. Lin, S. X., et al., (2010): Molecular therapy of breast cancer: progress and future directions, Nature Reviews Endocrinology, 6: 485-493.
3. Minotti, G., et al., (2004): Anthracyclines: Molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity, Pharmacological Reviews, 56: 185-229.
4. Kiyomiya, K., et al., (2001): Differences in intracellular sites of action of Adriamycin in neoplastic and normal differentiated cells, Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 47: 51-56.
5. Devalapally, H., et al., (2007): Role of nanotechnology in pharmaceutical product development, Journal of Pharmaceutical Sciences, 96: 2547-2565.
6. Riahi, S., et al., (2010): Computational Modeling of Interaction between Camptothecin and DNA Base pairs, International Journal of Electrochemical Science, 5: 1151-1163.
7. Vacek, J., et al., (2009): Ex situ Voltammetry and Chronopotentiometry of Doxorubicin at a Pyrolytic Graphite Electrode: Redox and Catalytic Properties and Analytical Applications, Electroanalysis, 21: 2139-2144.
8. Krizkova, S., et al., (2007): A suggestion of electrochemical biosensor for study of platinum(II)-DNA interactions, Electroanalysis, 19: 331-338.
9. Hynek, D., et al., (2012): Electrochemical Study of Doxorubicin Interaction with Different Sequences of Single Stranded Oligonucleotides, Part I, Int. J. Electrochem. Sci., 7: 13-33.

Poděkování

Práce byla finančně podpořena projekty CYTORES GAČR P301/10/0356, NANIMEL GAČR 102/08/1546, Liga proti rakovině Praha 2011 a CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.