Dvoudimenzionální elektroforetická (2DE) analýza proteomu karcinomu prsu.

Rakovinou prsu ročně onemocní v České republice více než 5000 žen a přes 2000 jich na karcinom prsu každý rok zemře. Při časném záchytu 5leté přežití překračuje 95%, při pozdním je jen 8%. V současnosti nemáme k dispozici jinou metodu pro včasný záchyt než mamografický screening a pravidelné sebevyšetřování prsů. Jak však zachytit tumor o velikosti několika milimetrů? Další palčivou otázkou je stanovení prognosy a optimální terapie, především v oblasti adjuvantní léčby.Často draze léčíme pacientky, které nemusí mít recidivu anebo se nepodaří recidivě zamezit. Je tato léčba skutečně nezbytná? K odpovědím na tyto otázky nám pomáhají biologické markery – prognostické a prediktivní faktory.
Biologické markery, jsou většinou proteiny, jejichž přítomnost či absence indikuje stav buňky a její změny během vývoje choroby. Proteiny produkované nádorovými buňkami se akumulují v buňce nebo jsou secernovány do plasmy. V současnosti může být část těchto bílkovin detekována imunohistochemickými metodami. Pokud jde o karcinom prsu, hlavní klinický význam mají estrogenní a progesteronové receptory a HER2. Jako serové markery se v klinické praxi rutinně využívají: polymorfní epitelový mucin (CA 15-3), kacinoembryonální antigen (CEA) případně cytokeratinové fragmenty. Jejich význam je omezen na výběr terapie, sledování dynamiky choroby a vyhledávání recidiv. Již řadu let se nepodařilo škálu biologických markerů u karcinomu prsu zásadně rozšířit. Ideální by bylo nalézt proteinové markery indikující časná stadia karcinomu prsu, ještě před tím, než je nádor detekovatelný mamografií.
Po přečtení lidského genetického kódu, společně s pokrokem v proteinové analýze, především díky hmotnostní spektrometrii, se zlepšením možností identifikace proteinů, je předpoklad studia funkce sítě proteinů v buňce. To umožní lepší pochopení mechanismu vývoje nádorů, stejně jako identifikaci proteinových targetů pro léčbu a proteinových markerů pro časnou detekci a prognostiku.
Základní technikou proteomové analýzy je stále dvourozměrná gelová elektroforesa kombinovaná s hmotnostní spektrometrií vybraných proteinů. Proteomické studie u karcinomu prsu se zaměřují na zjišťování rozdílů v expresi proteinů mezi normálními a nádorovými buňkami. Rozdíly byly prokázány v oblasti buněčného skeletu – cytokeratinů a tropomyosinu, molekulách chaperonů (členů rodiny heat shock proteinu, protein folding enzymů) a v expresi glykolytických enzymů.
Nádor ani normální tkáň prsu není složena jen z jednoho typu buněk. Prsní žláza se skládá z alveolů a navazujícího systému vývodů uložených v pojivové tkáni. Epiteliální buňky jsou uspořádány ve dvou vrstvách: luminální – jež případně produkuje mléko a basální – myoepiteliální jež zajišťuje strukturu a kontraktilitu s ejekcí mléka. Rozlišení mezi jednotlivými typy buněk je morfologické a histochemické – především cytokeratiny 5,14, 17 a actin hladkých svalů (SMA) jsou považovány za myoepitelové markery, zatímco cytokeratiny 7, 8, 18 a 19 jsou markery luminálních buněk. Je předpokladem, že terminálně diferencované buňky luminální i myoepitelové pocházejí z progenitorových buněk a právě tyto progenitorové buňky jsou nejspíše primárním místem nádorové transformace i zdrojem pro celou populaci buněk nádoru. Tento proces probíhá pod vlivem růstových faktorů, hormonů a intercelulárních interakcí.
Výběr proteinových vzorků pro 2DE je zásadní. Lze použít jak přímo nádorovou tkáň, tak kultivované nádorové buňky či linie nádorových buněk. Při použití normálních i nádorových tkání jsou analýze podrobeny jak buňky karcinomu či žlázy, tak všechny ostatní buňky vzorku, včetně krevních elementů. V této fázi výzkumu jsme zvolili analýzu in vitro pěstovaných buněk karcinomu prsu (EM-G3) a normální mammární epiteliální tkáně (NME).
Dr. Matoušková z naší skupiny optimalizovala metodiku kultivace buněk karcinomu prsu s podporou kultivace pomocí letálně ozářených fibroblastů a růstových faktorů ve standardizovaném růstovém mediu. Touto technikou byly kultivovány buňky nádorů pacientek. Z proliferující linie nádoru pacientky byl ve sté pasáži odvozen klon, který byl stabilizován jako nová klonální linie lidského karcinomu prsu EM-G3. Imunohistochemický profil této linie ukazuje na původ z progenitorových buněk v časné fázi kancerogeneze.

Výsledky
2-DE gely byly připraveny jak z normálních (NME) tak nádorových buněk (EM-G3). Po úvodních gelech s pH 3-10 byla vybrána oblast pH 4-7 jako optimální. Na obr 1 vidíte reprezentativní 2DE gely normálních (NME) a nádorových (EM-G3) buněk. Tyto 2DE mapy jsou vysoce reprodukovatelné.

Identifikace proteinů:
Pro identifikaci proteinů byla použita digesce trypsinem na peptidy, extrakce peptidů z gelu a MALDI – TOF spektrometrie s vyhledáním příslušného proteinu v databázi. Identifikovali jsme 60 proteinových spotů exprimovaných při pH 4-7. Nejdříve jsme identifikovali proteiny z gelů linie EMG3, abychom získali základní orientaci v proteinové mapě karcinomu prsu a dále je porovnali s proteiny NME. Identifikované proteiny jsou shrnuty v tabulce 1 a obr. 2. Lokalizace identifikovaných proteinů je v souladu s dosud publikovanými 2DE mapami prsních epitelií.


Tabulka č. 1
Proteiny identifikované v buňkách EM-G3

Rozdíly mezi normálními a nádorovými buňkami:
Celkem jsme našli rozdíly v expresi 8 proteinů mezi normálními NME a nádorovými buňkami EM-G3. Hlavní rozdíly jsou v expresi cytokeratinů. V buňkách EM-G3 (obr. 2) je exprimován cytokeratin 13, který chybí v buňkách NME, cytokeratin 16 a cytokeratin 19 jsou exprimovány pouze v NME buňkách. Anexin 5 a protein chloridového kanálku CLIC 1 byly exprimovány pouze v buňkách EM-G3 (obr. 3). Kaspaza 14/a a Katepsin B řetězec B a peptid SCCA 1 jsou exprimovány pouze v buňkách NME (obr. 4.).


Obr. 1: 2 DE gely normálních (NME) a nádorových buněk (EM-G3)



Obr 2: Detekované proteiny v buňkách linie EM-G3


Obr. 3:
Exprese proteinů v normálních (NME)
a nádorových (EMG3) buňkách

Obr. 4:

Exprese SCCA 1 v normálních (NME)
a nádorových (EMG3) buňkách

Závěr
V rámci výzkumného úkolu „prediktivní a prognostické faktory karcinomu prsu“ se podařilo optimalizovat metodiku dvourozměrné gelové elektroforezy (2DE) proteinů z buněk karcinomu prsní žlázy. Pomocí MALDI – TOF spektrometrie se podařilo identifikovat 60 proteinových spotů v progenitorových buňkách karcinomu prsu (EM-G3) a v normálních buňkách prsní žlázy (NME). Našli jsme rozdíly v expresi některých proteinů mezi nádorovými a normálními buňkami. Cytokeratin 13 exprimovaný v buňkách EM-G3 může být novým markerem progenitorových buněk karcinomu prsu. Ztráta exprese SCC1 antigenu v buňkách EM-G3 může souviset s nízkým stupněm diferenciace těchto pluripotentních buněk. Exprese Anexinu 5 – proteinu regulovaného Ca2+ a proteinu chloridového kanálku (CLIC1) je charakteristickou vlastností progenitorových buněk EM-G3. V další práci, v rámci výzkumného úkolu, budeme tyto vlastnosti ověřovat na panelu buněk z nádorů pacientek s karcinomem prsu.

Podpořeno grantem IGA MZČR NR/8323-3