DIMSCAN: systém pro měření cytotoxicity in vitro pomocí fluorescenční mikroskopie

Testování látek s možným protinádorovým účinkem na tkáňových kulturách je významnou součástí procesu vývoje nových léčiv. Naším cílem bylo vyvinout automatizovaný systém, který za použití 6až 384-jamkových mikrotitračních destiček umožní rychlé souběžné testování cytotoxického účinku různých koncentrací jednotlivých látek i kombinací látek in vitro s následným vyhodnocením jejich případného synergického účinku.
Systém DIMSCAN (Digital Image Microscopy Scanning) na základě digitální zobrazovací mikroskopie kvantifikuje relativní počet živých buněk v mikrotitračních deskách (nejčastěji 96-jamkových). Živé buňky jsou in situ barveny fluorescenčním barvivem FDA (fluorescein diacetát); světelný šum okolního média je eliminován nastavitelným prahováním (tresholding) a aplikací barviva 2’4’5’6’-tetrabromofluorescein (eosin Y) bezprostředně před analýzou. Při studiích cytotoxicity je poměr přeživších buněk stanoven ve vztahu ke kontrolní skupině, přítomné na každé analyzované 96-jamkové desce.
Citlivost a linearita systému DIMSCAN byly testovány na řadě tkáňových kultur rostoucích adherentně (neuroblastom) i volně (leukémie). V současnosti používaná 3. generace systému DIMSCAN 3.0 dosahuje lineárního vztahu mezi počtem živých buně k (1 až 10000 buně k na jamku umístě ných pomocí průtokového cytometru) a kvantifikací relativní fluorescence: r² = 0,99967±0,0003 (lineární regrese prvního řádu), s dynamickým rozsahem přesahujícím 4 logaritmy. Linearita a dynamický rozsah analýzy byly zachovány i při pětkrát opakovaném skenování téže mikrotitrační desky. Detekce jediné leukemické buňky v mikrotitrační jamce byla úspěšná u 93 % jamek s nulovou falešnou pozitivitou při skenování jamek neosazených živými buňkami.
Výsledky DIMSCAN analýzy cytotoxického účinku léků a jejich kombinací byly porovnávány s výsledky testů klonogenicity (colony forming assay – CFA) a tetrazoliových MTT testů. Cytoxicita v závislosti na koncentraci deferoxamin mesylátu (DFO) u tkáňových kultur neuroblastomu zaznamenaná pomocí DIMSCAN systému a CFA byla srovnatelná, s dynamickým rozsahem vyšším o více než 2 logaritmy v případě DIMSCAN analýzy.
Při testování cytotoxicity kombinací léků (fenretinid + safingol, buthinonin sulfoximid + melphalan) byly výsledky DIMSCAN metody srovnatelné s výsledky MTT testů, opět s výraznějším dynamickým rozsahem DIMSCAN systému, který díky tomu citlivěji stanovoval synergický účinek testovaných kombinací léků.
Analýza jedné 96-jamkové mikrotitrační desky systémem DIMSCAN 3.0 trvá 6 minut. Díky automatickému zaostřování a ukládání miniaturních obrázků (thumbnails) všech skenovaných jamek může analýza probíhat bez dohledu. DIMSCAN 3.0 tak představuje robustní fluorescenční analyzátor pro automatizované, rychlé a přesné testování cytotoxického a synergického účinku na tkáňových kulturách s dynamickým rozsahem přesahujícím 4 logaritmy.