Diagnostika lymfadenopatií průtokovou cytometrií

Úvod:

Diagnostika maligních lymfomů se opírá o histologické vyšetření tkáně lymfatických uzlin. V naší nemocnici jsou všechny extirpované uzliny vyšetřovány nejen histologicky, ale i pomocí průtokového cytometru (FCM).

Cíl:

Cílem naší retrospektivní studie bylo ověření úspěšnosti flowcytometrické diagnostiky lymfomů ve srovnání s histologickým vyšetřením.

Metodika:

Tkáň rozmělníme skalpelem a dalšími preparačními nástroji na malé částečky, které následně homogenizujeme v 3 ml fosfátového pufru (PBS) pomocí mixéru (ULTRA-TURAX S8N-8G) na jemnou suspenzi buněk. Přidáme lyzační činidlo a inkubujeme 10 min. Po inkubaci centrifugujeme 5 min./1500 otáček. Odstraníme supernatant a 2x promyjeme v nadbytku fosfátového pufru s telecím sérem (BSA) a azidem (PBS dle DAKO). Centrifugujeme 5 min./1500 otáček. Promytý homogenizát uzliny přefiltrujeme přes filtr CellTrick (PARTEC 50 µm) a vzorek je připraven k značení monoklonálními protilátkami.

K přímému značení buněk používáme různé trojkombinace monoklonálních protilátek (tab. 1), které umožňují detekci neoplastické lymfoidní populace. Dle diagnózy na průvodce může být panel doplněn o další kombinace protilátek, např. pro detekci plazmatických buněk.

Připravené vzorky jsou analyzovány a vyhodnocovány na průtokovém cytometru FACSCalibur^TM fy. Becton Dickinson pomocí softwaru CellQuest^TM .

Výsledky:

Od ledna 2006 do června 2007 jsme zpracovali celkem 139 lymfatických uzlin.

U 73 pacientů (graf č. 1) byl histologicky prokázán maligní lymfom (Hodgkinova choroba = 16, NHL = 57), u 3 pacientů byl prokázán extramedulární plazmocytom. V ostatních případech se jednalo jen o zánětlivé změny, či nehematologickou malignitu. V případě Hodgkinovy choroby byla imunofenotypizace vždy negativní. U non-Hodgkinských lymfomů byla neshoda mezi histologickým a FCM výsledkem poměrně vysoká (39%), a to díky skupině DLBCL (n=19), ve které pouze ve 2 případech byla pozitivní i FCM, a skupině PTCL ( n=2), kterém se nepodařilo FCM odhalit. U ostatních typů NHL ( jako např. FCL, SLL/CLL, MCL, MZL, LPL ) se výsledky shodovaly v 94% (graf č. 2) V žádném případě nebyla pozitivní imunofenotypizace při negativním histologickém nálezu.

Závěr:

Imunofenotypizace lymfatických uzlin je rychlá vyšetřovací metoda, která je, krom skupiny difúzních velkobuněčných B lymfomů a periferních T buněčných lymfomů, spolehlivá v diagnostice NHL. Dle imunofenotypu lze většinou určit i jejich přesný typ. U Hodgkinovy choroby není flowcytometrické vyšetření uzliny diagnosticky přínosné. Navzdory výše uvedenému je pro diagnostiku maligních lymfomů prvořadé histologické vyšetření lymfatické uzliny.

Práce podpořena výzkumným záměrem VZ MZO 00064165 a MZ 216 20 808.

Přílohy

Tab. 1: Panel monoklonálních protilátek určený k vyšetřování lymfatických uzlin



Graf č. 1: Procentuální zastoupení jednotlivých typů maligních lymfomů v histologicky pozitivních uzlinách



Graf č. 2: Porovnání výsledků průtokové cytometrie a histologického vyšetření.



Pozn.: Shoda - pozitivní histologické i flowcytometrické vyšetření

Neshoda - pozitivní histologické vyšetření, flowcytometrie negativní