Diagnostika genu EML4-ALK a jeho prediktivní význam u nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC)

Úvod:

Do cílené biologické terapie pacientů s NSCLC se kromě EG FR tyrozinkinázových inhibitorů (EG FR TKI ) zařadily i inhibitory genu ALK (anaplastic lymphoma kinase) a jeho onkogenních variant (ALK TKI ). V ČR je první z tohoto typu léčiv, crizotinib (Xalkori), registrován pro léčbu nemocných s již dříve léčeným pokročilým NSCLC s pozitivním průkazem přestavby ALK genu. Diagnostika přestavby využívá metod FISH, IHC nebo RT-PCR. Pro indikaci crizotinibu je v USA nutný průkaz pozitivity přestavby ALK stanovený metodou FISH, v E vropě je jako hodnotící metoda uznávána validovaná metoda bez bližší specifikace. Nejčastější přestavbou ALK genu u N SCLC je fúze EML4-ALK, v 80 % se jedná o variantu 1, 2 nebo 3.

Cíl:

Naším záměrem bylo navrhnout metodu na bázi reverzně transkripční real time PCR pro detekci variant 1, 2 a 3 fúze EML4-ALK, následně touto metodou analyzovat skupinu vzorků pacientů s N SCLC a výsledky real time PCR porovnat s dostupnými výsledky dalších laboratorních metod (FISH, end-point PCR, přímá sekvenace, CE IVD diagnostická souprava).

Metody:

Výchozím materiálem byly histologicky konfirmované vzorky NSCLC ve formě fixované tkáně (FFPE) nebo cytologické nátěry. Pro izolaci RNA byl použit RN easy FFPE Kit (Qiagen). Reverzní transkripce byla provedena pomocí SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen). Pro detekci varianty 1, 2 a 3 fúze EML4-ALK byla použita nově navržená metoda real time PCR s TaqMan sondami, end-point PCR a přímá sekvenace. Analýzy FISH byly provedeny pomocí Zyto Light SPEC ALK Dual Color Break Apart Probe (ZytoVision). Pro ověření výsledků byla použita diagnostická souprava EML4-ALK Fusion Gene Detection Kit CE IVD (Amoy Diagnostics).

Výsledky:

Zavedli jsme metodu real time PCR pro analýzu varianty 1, 2 a 3 fúzního transkriptu EML4-ALK. Senzitivita metody je 10-3 – 10-4. Metoda byla použita pro analýzu 96 pacientů s NSCLC, přestavba EML4-ALK byla zachycena ve 33 případech (34 %). U všech 33 EML4-ALK pozitivních vzorků byla fúze potvrzena přímou sekvenací. V souboru 46 vzorků bylo provedeno srovnání FISH, real time PCR a end-point PCR. V tomto souboru bylo 8 FISH pozitivních vzorků, které byly dále analyzovány metodou real time PCR, end-point PCR a diagnostickou soupravou EML4-ALK Fusion Gene Detection Kit. Pozitivita EML4-ALK byla potvrzena metodou real time PCR ve 4 případech, diagnostickým kitem ve 3 případech a metodou end-point PCR u 2 vzorků.

Závěr:

Navržená metoda reverzně transkripční real time PCR pro detekci tří nejčetnějších variant fúze EML4-ALK je vysoce senzitivní, časově i finančně dostupná. Námi zjištěná frekvence výskytu fúzního genu je vzhledem k citlivosti použité metody vysoká. Rozdíly mezi výsledky různých metod nejsou v rozporu s publikovanými údaji, diference mohou být způsobeny rozdílnou citlivostí a principem metod, variabilitou vyšetřovaného materiálu nebo heterogenitou nádoru. Metoda real time PCR může vzhledem k vysoké citlivosti přispět k přesnější analýze přestavby genu ALK a následně zvýšit podíl pacientů s N SCLC léčených ALK TKI .