Detekcia mutácií BRAF génu vo wild type GISToch

 Úvod: GISTy, a teda gastrointestinálne stromálne nádory reprezentujú najčastejšie mezenchymálne nádory gastrointestinálneho traktu. Priemerný vek výskytu tohto ochorenia u ľudí je 60 ± 10rokov. Postihuje obe pohlavia rovnako. Pochádzajú z intersticiálnych Cajalových buniek mutáciou v dvoch genoch kódujúcich bunkové receptory. Napriek klinickopatologickým rozdielom, GISTy nesú onkogénnu mutáciu v KIT alebo PDG FRα gene. Tieto mutácie znižujú apoptózu a vedú k ligand-nezávislej aktivácii a signálnej transdukcii tyrozin-kinazových receptorov KIT a PDG FRα, čo zvyšuje proliferáciu nádorových buniek. Mutácie exónov 9,11,13,17 KIT genu a exónov 12,14,18 PDG FRα genu tvoria asi 85% všetkých prípadov GISTov. Vzhľadom na to, že u zvyšných 15% GISTov stále nepoznáme genetickú podstatu (tzv. wild-type GISTy), je potrebné hľadať stále nové diagnostické biomarkery, ktorých mutácie by mohli byť zodpovedné za vznik ochorenia. Na základe wild type genotypu sa nedá predpokladať maligný potenciál, typická lokalizácia či veľkosť nádoru, ale je s ním spojená zlá odpoveď na inhibítory tyrozin-kináz (imatinib). Súčasné štúdie poukazujú čoraz viac na úlohu ďalšieho protoonkogénu v tumorigeneze GISTov. B-RAF protein je serin-treonin protein kináza, ktorá je dôležitým efektorom RAS aktivácie, a preto je zahrnutá RAS-BRA F-ERK signálnej dráhe, ktorá je kritická pre transkripčnú reguláciu. Z tohto dôvodu predpokladáme, že mutácie B-RAF genu majú významnú úlohu pri vzniku WT-GISTov.

Metodika: Naša štúdia pozostáva zatiaľ zo 43 formalinom fixovaných, v parafíne ukotvených vzoriek nádorového tkaniva extrahovaných z rôznych častí gastrointestinálneho traktu. Pacienti boli vo veku 43–68 rokov. Všetky vzorky boli KIT a PDG FRα negatívne. DNA sme izolovali z 2–5 parafinových rezov o hrúbke 5μm. Primery sme navrhli na amplifikáciu exónu 15, pretože mnohé mutácie boli detegované práve v exóne 15. Vzorky sme sekvenovali pomocou dideoxysekvenacie podľa Sangera. „Hotspot“ miestom exónu 15 je mutácia V600E (1799 TA).

Výsledky:  B-RAF mutáciu sme detegovali len v jednom prípade zo 43 vzoriek. Mutácia sa vyskytla v blízkosti „hotspot“ miesta. Vzorka pochádzala z rektálneho nádoru s vysokou mitotickou aktivitou. Tumor patril do skupiny s vysokým rizikom malígneho správania.

Diskusia: V porovnaní s publikovanými prácami sme našli signifikantne nižšiu frekvenciu B-RAF mutácií. Jedným z dôvodov môže byť práve zvolená metôda sekvenovania. Kým pri detekcii KIT a PDG FRα mutácii je dideoxysekvenacia postačujúca, pri detekcii B-RAF mutácii odporúčame zvoliť senzitivnejšiu metôdu.

Záver: B-RAF mutácie majú významnú úlohu pri patogenéze wild-type GISTov, napriek tomu, že sú pomerne málo preštudované. Štúdia potvrdzuje potrebu rozšírenejšieho genetického testovania wild-type GISTov hlavne z dôvodu ich horšej odpovede na liečbu inhibítormi tyrozin-kináz.