Detekcia MPL mutácií u JAK2 negatívnych pacientov

Úvod: Polycythemia vera (PV), esenciálna trombocytóza (ET) a primárna myelofibróza (PMF) patria do skupiny Ph1 negatívnych myeloproliferatívnych neoplazií (MPN), pri ktorých sa často vyskytuje mutácia JAK 2V617F. Táto mutácia sa vyskytuje takmer u všetkých pacientov s PV a u približne 60% pacientov s ET a PMF. V diferenciálnej diagnostike MPN však význam tejto mutácie stále nie je dostatočne objasnený. Jednou z ďalších mutácií, ktoré sa vyskytujú iba u pacientov s ET a PMF, sú mutácie genu MPL, kódujúceho trombopoetínový receptor. Najčastejšia mutácia je MPL –W515L/K, nájdená však iba u 5% JAK 2 negatívnych pacientov. Trombopoetin a jeho receptor MPL je nevyhnutný pre prežívanie a diferenciáciu hematopoetických kmeňových buniek a spolu tvoria kľúčový regulačný faktor pre vývin megakaryocytov a tvorbu krvných doštičiek. U pacientov s MPN dochádza k zníženej expresii MPL v dôsledku chybnej posttranslačnej modifikácie.

Metodika: Do dnešného dňa sme vyšetrili 80 vzoriek kostnej drene od pacientov s klinicky verifikovanou ET a PMF. Vzorky boli fixované formalínom a ukotvené v parafínovom bločku. Nami implementovaná metodika detekcie mutácie MPL z parafínových bločkov umožnila analýzu veľkého množstva archívneho materiálu pre retrospektívne štúdie. Použitie parafínových bločkov však so sebou prinieslo viaceré komplikácie, ale po ich odstránení sa nám podarilo osekvenovať všetkých 80 vzoriek. Použili sme primery umožňujúce amplifikáciu celého exonu 10. Proces amplifikácie prebiehal pomocou touch-down PCR. Vzorky sme sekvenovali využitím dideoxysekvenacie podľa Sangera.

Výsledky:  MPL mutáciu sme detekovali len v jednom prípade z 80 vzoriek. V druhom prípade zmeny sekvencie bol prítomný polymorfizmus. Mutácia W515K, ktorú sme identifikovali, sa vyskytuje približne u 5% pacientov s PMF a ET.

Diskusia: Vzhľadom na počet vyšetrených vzoriek, musíme konštatovať, že počet detegovaných mutácii je prinízky. Avšak vzhľadom na zriedkavosť mutácii MPL receptora u Ph- negatívnych pacientov v populácii, je nízky záchyt mutácií prirodzený. Druhým radikálnejším dôvodom takého nízkeho počtu mutácii sa javí zvolená metóda sekvenácie, preto by sme odporúčali iné metódy ako je napr. pyrosekvenovanie či next generation sequencing.

Záver: Význam mutovaného MPL receptora, a teda aberantne glykozylovaného je v MPN ochoreniach stále nejasný. Prognostický význam mutácii a ich prínos v patogenéze MPN sa očakáva v blízkej budúcnosti. Rozdiel medzi zachytením MPL mutácií pomocou Sangerovho sekvenovania a next generation sequencing je značný a je možné, že aj v našom súbore je v skutočnosti tých mutácii oveľa viac. Objavili sa práce, ktoré dokazujú veľké rozdiely v záchyte mutácii MPL genu. V budúcnosti by sme chceli preto naše vzorky analyzovať skôr inou metodikou ako je pyrosekvenovanie alebo next- generation sequencing, ktoré sú asi na túto analýzu vhodnejšie a senzitivnejšie.